一、背景
小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株是一種來源于小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞系。這些細(xì)胞具有神經(jīng)元的特征，可以用于研究視覺信號(hào)傳導(dǎo)、神經(jīng)退行性疾病等方面的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究。
小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株可以通過體外培養(yǎng)獲得，常用的培養(yǎng)方法包括貼壁法和懸浮法。貼壁法是將小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞接種在含有特定培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，經(jīng)過一段時(shí)間的生長(zhǎng)和分化，形成單層貼壁的神經(jīng)元。懸浮法是將小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞懸浮在含有特定培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，通過離心等方法分離出神經(jīng)元進(jìn)行培養(yǎng)。
小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株在研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，例如可以用于研究視覺信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展等。此外，還可以用于藥物篩選和毒性評(píng)價(jià)等領(lǐng)域的研究。
二、小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞株可以用于TGFβ信號(hào)通路在小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞軸突再生過程中作用的實(shí)驗(yàn)研究：
以小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(Retinal ganglion cells,RGCs)為研究對(duì)象,觀察轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(Transforming growth factorβ,TGFβ)信號(hào)傳導(dǎo)通路在小鼠RGCs軸突再生過程中的作用。
本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用木瓜蛋白酶消化法、免疫磁珠篩選等方法成功分離獲得小鼠RGCs,Brn3b免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色對(duì)其進(jìn)行鑒定,應(yīng)用Calcein AM及Hoechst對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色,從而在12個(gè)蛋白激酶抑制劑中成功篩選出促小鼠RGCs存活及其神經(jīng)突再生的4個(gè)候選激酶抑制劑即TGFβ?型受體激酶抑制劑(TGFβReceptor Inhibibitor,TGFβRI)(AL 47070)、P38MAP激酶抑制劑(AL 42243、AL 42245、AL 46144),其中作用最明顯的為TGFβ?型受體的抑制劑(AL 47070);
應(yīng)用Realtime PCR檢測(cè)TGFβ下游靶基因IGF1、NRP2、IL6,發(fā)現(xiàn)AL 47070作用組與對(duì)照組相比較IGF1、NRP2、IL6表達(dá)明顯下降,說明AL 47070從mRNA水平阻斷了TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)通路;應(yīng)用Western-blot方法檢測(cè)TGFβRI(AL 47070)作用小鼠RGCs后,總Smad2、P-smad2、總Smad3、P-smad3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)總Smad2、Smad3并未有明顯變化,而P-smad2、P-smad3明顯下降,說明從蛋白水平證明TGFβRI(AL 47070)阻斷了小鼠RGCs的TGFβ信號(hào)傳導(dǎo);應(yīng)用MAP2b和Tau免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色,發(fā)現(xiàn)TGFβR(IAL 47070)作用小鼠RGCs后即有MAP2b和Tau雙陽性的神經(jīng)突還有MAP2b染色陽性而Tau染色陰性的神經(jīng)突,證明在體外細(xì)胞培養(yǎng)模式下,阻斷TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)通路可以促進(jìn)小鼠RGCs樹突及其軸突再生;
應(yīng)用Calcein AM及Hoechst免疫細(xì)胞熒光化學(xué)染色成功的證明在細(xì)胞培養(yǎng)條件及視網(wǎng)膜組織塊培養(yǎng)條件下,TGFβRI(AL 47070)比已知的對(duì)軸突再生有促進(jìn)作用的神經(jīng)營養(yǎng)因子如BDNF、CNTF、GDNF強(qiáng);
此外,建立小鼠視神經(jīng)夾傷模型,應(yīng)用甲苯胺藍(lán)尼氏小體染色發(fā)現(xiàn)手術(shù)組比未手術(shù)組細(xì)胞明顯減少,證明我們模型建立成功,應(yīng)用GAP-43免疫組織熒光化學(xué)對(duì)視神經(jīng)進(jìn)行染色,證明在視神經(jīng)損傷的情況下,阻斷TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)可以促進(jìn)小鼠RGCs軸突再生。
綜上所述,本實(shí)驗(yàn)成功的分離培養(yǎng)小鼠RGCs,分別在體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)阻斷TGFβ信號(hào)傳導(dǎo)能路可以促進(jìn)小鼠RGCs的軸突再生。為治療青光眼等視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷疾病提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),期望能為治療青光眼等疾病提供新思路及手段。
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