一、背景
MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系是一種來源于人類乳腺癌的細(xì)胞系，它最初是由美國國立癌癥研究所(NCI)于1970年代從一名患有乳腺癌的女性體內(nèi)分離出來的。這種細(xì)胞系在實(shí)驗(yàn)室中被廣泛用于研究乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和治療。
二、MDA-KB2細(xì)胞系的特點(diǎn)包括
貼壁生長：MDA-KB2細(xì)胞系可以在含有血清的培養(yǎng)基中貼壁生長，形成單層或多層的細(xì)胞群落。
異質(zhì)性：MDA-KB2細(xì)胞系具有較高的異質(zhì)性，即不同克隆的細(xì)胞在形態(tài)、生長速度和基因表達(dá)等方面存在差異。
耐藥性：MDA-KB2細(xì)胞系對多種化療藥物具有耐藥性，這使得它成為研究乳腺癌耐藥機(jī)制的重要工具。
基因突變：MDA-KB2細(xì)胞系中存在多個(gè)已知的致癌基因突變，如TP53、PIK3CA等。這些突變可能與該細(xì)胞系的惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)。
三、MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系可以用于鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)：
利用受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn)檢測鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物內(nèi)分泌干擾效應(yīng)
應(yīng)用雌激素受體(ER)、雄激素受體(AR)以及甲狀腺激素受體(TR)介導(dǎo)的MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系報(bào)告基因試驗(yàn)檢測三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物:鄰苯二甲酸乙基己基酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)和鄰苯二甲酸單丁酯(MBP)的擬或(抗)雌激素、雄激素和甲狀腺激素活性,并對三種化學(xué)物的激素干擾效應(yīng)進(jìn)行比較。
方法：
1、雌激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn):將表達(dá)大鼠ERα的質(zhì)粒rERα/pCI與重組Luc報(bào)告基因質(zhì)粒pERE-aug-Luc共轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞。根據(jù)受試化學(xué)物能否誘導(dǎo)Luc的表達(dá),以及能否拮抗E2誘導(dǎo)的Luc的表達(dá),判斷受試化學(xué)物的ER激動和拮抗效應(yīng)。
2、雄激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):應(yīng)用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了pMMTV-Luc的MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系,將受試化學(xué)物單獨(dú)染毒細(xì)胞,以及與AR拮抗劑氟他胺(Flu)共同染毒,檢測Luc的表達(dá)情況,判斷受試化學(xué)物的AR激動效應(yīng),將受試化學(xué)物與雙氫睪酮(DHT)共同染毒,檢測其AR拮抗效應(yīng)。
3、甲狀腺激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn):將表達(dá)人TRβ配體結(jié)合域和Gal4-BD(酵母轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域)融合蛋白的質(zhì)粒pGal4-L-TRβ與Gal4反應(yīng)的報(bào)告基因質(zhì)粒pUAS-tk-luc共轉(zhuǎn)染CV-1細(xì)胞,根據(jù)該物質(zhì)能否誘導(dǎo)Luc的表達(dá)以及拮抗T3誘導(dǎo)的Luc表達(dá),判斷受試化學(xué)物的TR激動作用和拮抗作用。
結(jié)果：
1、雌激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn):三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物中DEHP和MBP幾乎不能誘導(dǎo)Luc的表達(dá),與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,DBP在高濃度能誘導(dǎo)Luc的表達(dá),最高誘導(dǎo)倍數(shù)為溶劑對照的2.6倍。三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物均無法抑制10-9 M E2所誘導(dǎo)的Luc表達(dá)。
2、雄激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):DBP、MBP和DEHP均可以誘導(dǎo)MDA-KB2人正常乳腺貼壁細(xì)胞系Luc的表達(dá),EC50分別為6.17×10-6、1.13×10-5和大于10-4 M。將三種化學(xué)物與10-5 M Flu共同染毒,三種化學(xué)物誘導(dǎo)的Luc表達(dá)均被抑制。代謝產(chǎn)物MBP比DBP表現(xiàn)出更強(qiáng)的活性。DBP、MBP和DEHP均能抑制10-9 M DHT所誘導(dǎo)的Luc的表達(dá),IC50分別為1.05×106、1.22×107和大于104 M,抑制效應(yīng)強(qiáng)度:DEHP<DBP<MBP。
3、甲狀腺激素受體介導(dǎo)的報(bào)告基因試驗(yàn):DBP、MBP和DEHP均能抑制5×10-9 M T3所誘導(dǎo)的Luc的表達(dá),IC50分別為1.31×105,2.77×106和大于104 M,三種化學(xué)物的抑制效應(yīng)強(qiáng)度:DEHP<DBP<MBP。三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物均不能誘導(dǎo)Luc的表達(dá)。
結(jié)論：
1、所研究的三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物中DEHP、MBP無擬雌激素活性,DBP表現(xiàn)出較弱的擬雌激素活性。該三種化學(xué)物均無抗雌激素活性。
2、三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物均具有擬雄激素活性,其活性強(qiáng)度:DEHP<DBP<MBP,其中代謝產(chǎn)物MBP表現(xiàn)出比原型DBP更強(qiáng)的擬雄激素活性。三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物均具有抗雄激素活性,其活性強(qiáng)度:DEHP<DBP<MBP,其中代謝產(chǎn)物MBP表現(xiàn)出比原型DBP更強(qiáng)的抗雄激素活性。
3、三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物均具有抗甲狀腺激素活性,其活性強(qiáng)度:DEHP<DBP<MBP,其中代謝產(chǎn)物MBP表現(xiàn)出比原型DBP更強(qiáng)的抗甲狀腺激素活性。三種鄰苯二甲酸酯類化學(xué)物均無擬甲狀腺激素活性。
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