一、背景
NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系是一種常用的體外研究模型，用于研究人類肺癌的生物學(xué)特性和藥物敏感性。該細(xì)胞系源自一名患有非小細(xì)胞肺癌的患者，經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)而建立起來(lái)。
二、NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)
貼壁生長(zhǎng)：該細(xì)胞系在培養(yǎng)皿中貼壁生長(zhǎng)，形成典型的腫瘤細(xì)胞形態(tài)。
高增殖率：NCI-H526細(xì)胞系具有較高的增殖率，可以在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高的細(xì)胞密度。
EGFR突變：該細(xì)胞系中存在EGFR基因的突變，這使得它對(duì)一些針對(duì)EGFR的藥物具有敏感性。
對(duì)化療藥物敏感：NCI-H526細(xì)胞系對(duì)多種化療藥物具有敏感性，包括紫杉醇、順鉑等。
三、NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1) 復(fù)蘇NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系可以用于RNA干擾抑制人肺癌細(xì)胞HMGB1基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究：
研究在人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9、人肺腺癌細(xì)胞株A549、NCI-H526人肺癌貼壁細(xì)胞系、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981及人小細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H446中篩選高表達(dá)HMGB1的細(xì)胞株，作為人肺癌細(xì)胞HMGB1基因研究的理想材料，為下一步進(jìn)行的RNAi實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞模型的選擇奠定了基礎(chǔ)；
設(shè)計(jì)針對(duì)HMGB1為靶點(diǎn)的siRNA，觀察通過(guò)RNA干擾抑制HMGB1基因表達(dá)后，高表達(dá)HMGB1的人肺癌細(xì)胞株L9981增殖和侵襲能力的改變，體外驗(yàn)證HMGB1基因做為治療靶點(diǎn)的可行性；
為臨床開發(fā)應(yīng)用和探索腫瘤治療的新途徑提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)；應(yīng)用RNA干擾聯(lián)合基因芯片技術(shù)檢測(cè)HMGB1表達(dá)下調(diào)后肺癌細(xì)胞基因表達(dá)譜的差異情況，篩選與HMGB1相互作用的基因及可能的信號(hào)通路，探討HMGB1基因在肺癌中的作用機(jī)制。
方法：
1、常規(guī)培養(yǎng)人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC-9、人肺腺癌細(xì)胞株A549、人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981及人小細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H446，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot方法對(duì)人肺癌細(xì)胞HMGB1基因在4株細(xì)胞中的mRNA和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，篩選出高表達(dá)HMGB1基因的人肺癌細(xì)胞株。
2、根據(jù)siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)合成靶向HMGB1基因的siRNA，采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染已經(jīng)篩選出的高表達(dá)HMGB1的人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot檢測(cè)RNA干擾后HMGB1基因的沉默效果，評(píng)價(jià)siRNA設(shè)計(jì)的合理性及RNA干擾抑制HMGB1表達(dá)的有效性；確定RNA干擾抑制HMGB1表達(dá)確實(shí)有效后，培養(yǎng)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株L9981，分為3組進(jìn)行RNA干擾研究，分別為轉(zhuǎn)染靶向HMGB1基因的siRNA組，轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列組和空白對(duì)照組，于RNA干擾后48小時(shí)，用細(xì)胞活力計(jì)數(shù)儀測(cè)定3組細(xì)胞活力；分別在RNA干擾后24、48、72和96小時(shí)應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)3組細(xì)胞生存狀態(tài)，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率并繪制生長(zhǎng)曲線；應(yīng)用boyden chamber法檢測(cè)3組侵襲能力的差異。
3、采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑向人肺癌細(xì)胞L9981轉(zhuǎn)染靶向HMGB1基因的siRNA，下調(diào)HMGB1的表達(dá)。應(yīng)用Affymetrix HU133 plus 2基因芯片檢測(cè)人肺癌細(xì)胞L9981 HMGB1基因表達(dá)下調(diào)后，全基因表達(dá)譜的變化，并應(yīng)用GCOS(Gene-ChipOperation Software)軟件分析篩查數(shù)據(jù)，對(duì)相關(guān)基因和信號(hào)通路進(jìn)行綜合分析。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的微生物菌種查詢網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測(cè)序、購(gòu)買等服務(wù),是中國(guó)微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢類網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶來(lái)詢！