一、背景
NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系是一種人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系，通常在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中被用于體外實(shí)驗(yàn)。這種細(xì)胞系可以用于研究肺癌的發(fā)病機(jī)制、藥物篩選和毒性測(cè)試等。
二、NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3)NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系可以用于腫瘤新標(biāo)志物CAPS和ASCL2的預(yù)后意義和相關(guān)機(jī)制研究：
ASCL2在非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義背景:肺癌是目前世界上第二大腫瘤類型,其病人約占所有腫瘤病人的13.3%。在因腫瘤導(dǎo)致的死亡病例中,肺癌病例約占26.8%,位居所有腫瘤之首。ASCL2是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一,在胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的發(fā)育以及神經(jīng)前體細(xì)胞形成過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。
近年來(lái)有研究顯示,ASCL2在結(jié)直腸癌、胃癌組織中異常高表達(dá),并與了腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲遷移、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干性維持等過程密切相關(guān)。但ASCL2在肺癌中的表達(dá)及其功能尚不明確。
基于此,檢測(cè)了肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌中ASCL2的表達(dá),評(píng)估了其臨床病理學(xué)意義,并比較了ASCL2在鱗狀細(xì)胞癌和腺癌中表達(dá)和臨床意義的差異。
方法和結(jié)果：
1、采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemical,IHC)染色的方法檢測(cè)10例正常肺組織、79例SCC組織及67例AC組織中ASCL2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,ASCL2在SCC(5.89±2.79vs.2.40±1.02,p<0.001)和AC(4.78±2.92 vs.2.40±0.92,p=0.014)中的表達(dá)均顯著高于正常組織,且SCC中ASCL2的表達(dá)亦顯著高于AC中的表達(dá)(5.89±2.79vs.4.78±2.92,p=0.002)。
2、ASCL2的表達(dá)與SCC的TNM分期(p=0.010)、分化程度(p=0.010)密切相關(guān)。而在AC中,ASCL2的表達(dá)只與患者的臨床分期(p=0.018)呈正相關(guān),而與患者的年齡、性別、吸煙與否、分化程度無(wú)明顯相關(guān)性(均p>0.05)。
3、Kaplan-Meier生存分析法比較ASCL2高表達(dá)(ASCL2high)組患者與ASCL2低表達(dá)(ASCL2low)組患者的預(yù)后。
結(jié)果顯示,ASCL2high組SCC患者的總體生存率顯著低于ASCL2low組SCC患者(p=0.004)。ASCL2low組的SCC患者的中位生存時(shí)間為(74.8月,95%CI65.9-83.7),明顯長(zhǎng)于ASCL2high組SCC患者的中位生存時(shí)間(53.3月,95%CI43.4-63.2)。多因素回歸分析結(jié)果亦顯示,ASCL2的表達(dá)水平可作為SCC患者獨(dú)立的預(yù)后因素(HR=2.692,p=0.041)。然而在AC患者中,ASCL2的表達(dá)水平與預(yù)后并沒有顯著相關(guān)性(p=0.172),也不能作為患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)(HR=1.528,p=0.256)。
4、對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的資料進(jìn)行歸納,篩選出有完整隨訪資料的351例SCC標(biāo)本,439例AC標(biāo)本,以及50例正常支氣管上皮標(biāo)本和58例正常肺泡上皮標(biāo)本。分析顯示,在正常支氣管上皮、正常肺泡上皮、SCC及AC組織中ASCL2mRNA表達(dá)水平分別為-0.65±0.68、0.97±1.44、-0.4±0.81及-0.04±1.47。SCC和AC組織中ASCL2 mRNA的表達(dá)水平均顯著高于其對(duì)應(yīng)的正常上皮組織(p<0.001和p=0.006),并且SCC組織中ASCL2的表達(dá)亦顯著高于AC中的表達(dá)(p<0.001)。生存分析顯示,ASCL2high組SCC患者的預(yù)后明顯差于ASCL2low組患者(p=0.015),但AC患者的預(yù)后與ASCL2的表達(dá)水平未見明顯相關(guān)性(p=0.165)。
5、免疫組化結(jié)果顯示ASCL2主要表達(dá)于細(xì)胞漿中,與之前報(bào)道的ASCL2作為轉(zhuǎn)錄因子主要定位于細(xì)胞核相左。我們進(jìn)一步用免疫熒光的方法檢測(cè)了肺癌細(xì)胞及冰凍組織中ASCL2的定位情況。
結(jié)果顯示,在正常支氣管上皮細(xì)胞株HBE,肺腺癌細(xì)胞株A549,NCI-H647人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系和肺大細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H460和冰凍組織中ASCL2的熒光染色信號(hào)均主要定位于細(xì)胞漿。該結(jié)果提示ASCL2在細(xì)胞中的定位可能具有細(xì)胞類型依賴性。
結(jié)論：SCC和AC組織中ASCL2的表達(dá)水平顯著高于其對(duì)應(yīng)的正常組織,且相比于AC組織中的表達(dá)水平,SCC組織中ASCL2的表達(dá)水平顯著增加。在SCC患者中,ASCL2的表達(dá)與臨床分期及分化程度密切相關(guān),并可以作為患者獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。此外,ASCL2在肺癌組織中主要表達(dá)于細(xì)胞漿。
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