一、背景
SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系是一種常用的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系，通常用于研究淋巴細(xì)胞的生物學(xué)特性和基因表達(dá)。這種細(xì)胞系具有某些獨(dú)特的特征，例如高增殖能力、穩(wěn)定的生長(zhǎng)特性以及容易進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染等，使其在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系是一種小鼠骨髓瘤細(xì)胞系，由Ludwig等人在1980年代初期建立。這種細(xì)胞系來(lái)源于C57BL/6小鼠的骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多次傳代和適應(yīng)性培養(yǎng)，使其成為一種適合用于各種實(shí)驗(yàn)研究的高質(zhì)量細(xì)胞系。
在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面，SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系為圓形或卵圓形，具有貼壁生長(zhǎng)的特性。這些細(xì)胞通常處于懸浮狀態(tài)，但也可以在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行固定和染色，以便進(jìn)行顯微觀察和分析。
在遺傳學(xué)方面，SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系具有穩(wěn)定的基因組，可以進(jìn)行各種基因操作，例如基因敲除、轉(zhuǎn)染和表達(dá)等。此外，這種細(xì)胞系還可以用于制備抗體和其他生物分子，為生物醫(yī)學(xué)研究提供了重要的工具和資源。
二、SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1)復(fù)蘇SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
SP2/MIL-6小鼠骨髓瘤B淋巴懸浮細(xì)胞系可以用于MRL/lpr小鼠骨髓CXCL12表達(dá)失調(diào)促進(jìn)B淋巴細(xì)胞向骨髓歸巢：
研究MRL/lpr狼瘡鼠骨髓微環(huán)境中成骨細(xì)胞(Osteoblasts,OB)表面CXCL12對(duì)B淋巴細(xì)胞歸巢的影響;研究系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者骨髓及外周血中CXCR4+B淋巴細(xì)胞比例及CXCL12的表達(dá),以及與疾病活動(dòng)標(biāo)志物的相關(guān)性。
方法：
(1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C57BL/6和MRL/lpr小鼠外周血、骨髓及脾臟中CXCR4+B淋巴細(xì)胞的比例差異;qRT-PCR法檢測(cè)C57BL/6和MRL/lpr小鼠外周血、骨髓及脾臟中CXCL12表達(dá)差異;免疫熒光檢測(cè)C57BL/6和MRL/lpr小鼠骨髓微環(huán)境中CXCL12、成骨細(xì)胞OB及B淋巴細(xì)胞的空間關(guān)系。
(2)在體研究B淋巴細(xì)胞歸巢實(shí)驗(yàn):體內(nèi)輸注實(shí)驗(yàn)分組:1、C57BL/6小鼠;2、MRL/lpr小鼠;3、用CXCL12拮抗劑LIT-927提前12小時(shí)灌胃的MRL/lpr小鼠(MRL/lpr+LIT-927)。取MRL/lpr狼瘡小鼠脾臟,通過(guò)磁珠分選術(shù)分選出B220+的B淋巴細(xì)胞,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分選出的B淋巴細(xì)胞純度,隨后用活細(xì)胞染料CFDA-SE對(duì)分選出的B淋巴細(xì)胞進(jìn)行熒光染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CFDA染色效率。將CFDA標(biāo)記的B淋巴細(xì)胞(CFDA+B)通過(guò)尾靜脈分別輸注到三組小鼠體內(nèi),24小時(shí)后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組小鼠骨髓中CFDA陽(yáng)性的B淋巴細(xì)胞比例。
(3)取發(fā)病的同周齡的MRL/lpr小鼠分為兩組,一組用LIT-927灌胃(9.2mg/20g),另一組用等量LIT-927溶劑CMC-Na灌胃,每?jī)商煲淮?共兩周。兩周后,取兩組小鼠外周血及骨髓,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CXCR4+B淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞的比例及骨髓中pre-pro-B(CD19-B220+)及pro-B(CD19+B220+)細(xì)胞的比例。
(4)收取臨床上確診為SLE患者10例和健康對(duì)照組3例的骨髓,以及SLE患者4例和健康對(duì)照組6例的外周血,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CXCR4+B淋巴細(xì)胞比例;酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)骨髓及外周血中CXCL12的表達(dá);收集SLE患者臨床資料,與骨髓CXCR4+B淋巴細(xì)胞比例及CXCL12表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
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