一、背景
NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系是一種用于研究和治療小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系可以在實(shí)驗(yàn)室中培養(yǎng)，以研究肺癌的發(fā)病機(jī)制、藥物作用、腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等。
二、NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)步驟
1）復(fù)蘇NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細(xì)胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3）NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。棄培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進(jìn)行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入到凍存液中。
三、應(yīng)用
NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系可以用于刺五加多糖對(duì)人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞的抑制作用及免疫調(diào)節(jié)作用研究：
基于鉑類藥物的化學(xué)療法已經(jīng)成為小細(xì)胞肺癌(SCLC)患者的標(biāo)準(zhǔn)一線治療方法。大部分患者在早期化療中反應(yīng)良好,但極容易出現(xiàn)耐藥性,亦有一部分患者在最初治療階段即出現(xiàn)化療耐藥,但目前尚不清楚SCLC中順鉑耐藥性發(fā)展的機(jī)制。所以解決小細(xì)胞肺癌的化療耐藥成為SCLC的治療需要解決的關(guān)鍵問題。
在本研究中,第一部分利用數(shù)據(jù)庫信息分析了來自癌癥藥物敏感性基因組學(xué)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(GDSC,N=55)的全外顯子測(cè)序(WES)數(shù)據(jù)集和已發(fā)表研究的小細(xì)胞肺癌的隊(duì)列(N=101)的WES數(shù)據(jù)和整體生存率(OS),以尋找順鉑耐藥性靶基因和與不良預(yù)后相關(guān)的基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCLC中的DNAH10突變與原發(fā)順鉑耐藥性相關(guān)(P=0.0350),OS差(HR:3.445;P=0.00035)和較差的無進(jìn)展生存期(PFS)顯著相關(guān)(P=0.0142)。隨即應(yīng)用生物信息學(xué)分析單樣本基因集富集分析(ssGSEA)探索順鉑耐藥的潛在信號(hào)通路。ssGSEA顯示,DNAH10突變與FGFR和FGF的SPRY調(diào)控呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,與非經(jīng)典性WNT和AKT/IKK信號(hào)通路成正相關(guān)關(guān)系,并與腫瘤突變負(fù)荷(TMB)成正相關(guān)。
第二部分,選擇多株小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系(分別為DNAH10突變細(xì)胞H2066、NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系和野生型細(xì)胞H69,H446等),通過RT-PCR、Western blot及CCK8等功能實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)NCI-H841人小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系與DNAH10野生型細(xì)胞相比較,DANH10突變細(xì)胞中DANH10的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平均明顯升高,進(jìn)一步通過藥物敏感性實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)突變型細(xì)胞H2066的耐藥性明顯高于其它DANH10野生型細(xì)胞(H69,H446);當(dāng)使用siRNA敲低H2066細(xì)胞中DANH10的表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)敲低DNAH10的H2066細(xì)胞的IC50值降低。
第三部分,收集47例小細(xì)胞肺癌患者的臨床組織樣本,行免疫組化發(fā)現(xiàn)DNAH10蛋白表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿,而且與DNAH10未突變患者相比較,在突變患者的腫瘤組織中表達(dá)增高;同時(shí)根據(jù)47例患者的臨床資料,證實(shí)發(fā)生突變的患者生存期低于未突變患者,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜上所述,DNAH10突變可能具有預(yù)測(cè)小細(xì)胞肺癌原發(fā)化療耐藥性和不良生存的潛在價(jià)值。
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