一、背景
志賀氏菌屬通用PCR試劑盒是一種用于快速檢測志賀氏菌屬的生物試劑盒。志賀氏菌屬是一類革蘭氏陰性細菌，可引起人類細菌性痢疾，是一種常見的腸道傳染病。使用PCR試劑盒可以快速、準確地檢測出志賀氏菌屬，對于感染控制和疾病診斷具有重要意義。
志賀氏菌屬通用PCR試劑盒通常由一對特異性引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等成分組成。通過PCR反應(yīng)，可以特異性地擴增志賀氏菌屬的DNA片段，從而對其進行快速檢測。使用這種試劑盒的操作過程相對簡單，只需將樣品DNA加入到PCR反應(yīng)液中，經(jīng)過一系列溫度變化和反應(yīng)后，即可得到檢測結(jié)果。
志賀氏菌屬通用PCR試劑盒具有高靈敏度、特異性強、操作簡便等優(yōu)點，適用于臨床診斷、食品檢測、環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。然而，需要注意的是，PCR技術(shù)雖然具有高靈敏度和特異性，但也可能受到其他因素的干擾，如DNA提取效率、引物設(shè)計等。因此，在使用PCR試劑盒時，需要嚴格按照操作說明進行，并對結(jié)果進行仔細的分析和解釋。
二、志賀氏菌屬通用PCR試劑盒的操作步驟如下
1、樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無菌容器中。
2、DNA提?。簩⒉杉降臉颖具M行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應(yīng)保存在-20°C或更低的溫度下。
3、PCR反應(yīng)體系準備：根據(jù)試劑盒說明書的要求，配制PCR反應(yīng)體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。
4、PCR反應(yīng)：將提取的DNA加入到PCR反應(yīng)體系中，進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件和時間根據(jù)試劑盒說明書的要求進行設(shè)置。
5、結(jié)果分析：將PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進行熒光信號檢測，根據(jù)熒光信號的出現(xiàn)情況判斷是否存在志賀氏菌的感染。
三、應(yīng)用
志賀氏菌屬通用PCR試劑盒可以用于食源性致病菌多重PCR檢測試劑盒的研制與應(yīng)用：
食源性致病菌蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、沙門氏(Salmonellaspp)、大腸埃希氏菌0157:H7(E.coli-0157:H7)、志賀氏菌(Shigella spp)、金黃色葡萄球菌(Sta.aureus)、單增李斯特氏桿菌(Listeria monocy togenes)等菌屬或菌。通過大量的文獻參考和實驗,我們經(jīng)過篩選挑取種或?qū)匍g特異的序列及相應(yīng)引物,然后用這些引物對各種細菌的基因組序列進行志賀氏菌屬通用PCR試劑盒PCR擴增檢測其特異性,最終決定出用于檢測的最優(yōu)的目的基因及沙門氏菌的invA基因、單增李斯特菌溶血素hlyA基因和金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶Nuc基因、志賀氏菌的侵染性質(zhì)?？乖璈基因ipaH、、大腸埃希O157:H7的溶血素基因hlyAB、和致病性蠟樣芽孢桿菌的溶血素hblA基因設(shè)計了6對特異性引物,建立志賀氏菌屬通用PCR試劑盒三重PCR,可同時實現(xiàn)對六種食源性致病菌的檢測。
試驗過程中對志賀氏菌屬通用PCR試劑盒多重PCR反應(yīng)體系中引物添加量、鎂離子濃度、dNTPmixture添加量及退火溫度和循環(huán)數(shù)等影響要素進行優(yōu)化,確定了適宜的多重PCR反應(yīng)體系和擴增程序,即優(yōu)化的三重PCR反應(yīng)為:50uL反應(yīng)體系中,dNTP終摩爾量為10pmol,Mg2+75pmol,5U Taq酶,hlyAB、ipaH和hblA終摩爾量分別為5pmol、5pmol和20pmol,invA、hlyA和nuc終摩爾量分別為7.5 pmol、10 pmol和10 pmol,10×PCR反應(yīng)緩沖液5uL;志賀氏菌屬通用PCR試劑盒共同的擴增條件為:預(yù)變性(94℃,5 min);28個循環(huán):變性(94℃,30 s),退火(58℃,40 s)延伸(72℃,70 s);延伸:(72℃,12min)。對多重PCR擴增產(chǎn)物構(gòu)建標準質(zhì)粒,進行DNA測序,登錄Genebank將測序結(jié)果進行網(wǎng)上blast,從而證實PCR擴增產(chǎn)物確為目的擴增產(chǎn)物,因此該多重PCR反應(yīng)特異性較強。
本方法志賀氏菌屬通用PCR試劑盒對人工污染肉及肉制品,同時檢測六種食源性致病菌的靈敏度,O157:H7檢出極限為19.8 cfu/mL,志賀氏菌檢出極限可達17 cfu/mL,蠟樣芽孢桿菌檢出極限為17.7cfu/mL。沙門氏菌檢出極限為4.7 cfu/mL,單核細胞增生李斯特菌檢出極限可達17cfu/mL,金黃色葡萄球菌檢出極限為4.5 cfu/mL。
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