貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的一個新種，是革蘭氏陽性好氧細菌，菌體成桿狀，大小為0.5×(1.5?3.5) μm，內(nèi)生孢子，廣泛分布于自然界的水體、土壤、空氣、植物根系、植株表面和動物腸道等。貝萊斯芽孢桿菌最早是Ruiz-García等從位于西班牙馬拉加省(Málaga)拖雷德爾馬爾(Torredelmar)地區(qū)的一條名為貝萊斯河流(Vélez)的河口中分離的，因此被命名為貝萊斯芽孢桿菌，分離的兩株菌分別編號為CR-14b和CR-502T。近年來，國內(nèi)外有關(guān)貝萊斯芽孢桿菌的報道越來越多，研究主要集中在促進動植物生長、拮抗病原菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、抑菌物質(zhì)及其基因簇鑒定、拮抗作用機制等方面，該菌在生物防治、藥物研發(fā)、食品發(fā)酵和工業(yè)應(yīng)用等方面具有重要作用?？紤]到近年來貝萊斯芽孢桿菌作為芽孢桿菌的一個新種被廣泛關(guān)注，而且該菌在抑制病原菌和生物防治方面具有顯著的優(yōu)點。因此，本文對貝萊斯芽孢桿菌的分類地位、抑菌物質(zhì)及其合成相關(guān)基因、拮抗作用機制以及應(yīng)用研究等方面進行綜述，為貝萊斯芽孢桿菌的深入研究提供參考。
一、貝萊斯芽孢桿菌的分類地位
貝萊斯芽孢桿菌的種分類地位的確定比枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和蘇蕓金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)等芽孢桿菌晚，貝萊斯芽孢桿菌最早在1999年被分離到，直到2005年被首次報道和命名。貝萊斯芽孢桿菌的生理生化特性鑒定結(jié)果顯示：該菌能夠發(fā)酵七葉苷、苦杏仁苷、L-阿拉伯糖、熊果苷、纖維二糖、D-果糖、甘油、葡萄糖、糖原、肌醇、乳糖、麥芽糖、甘露醇、D-甘露糖、甲基α-D-糖苷、D-核糖、D-棉子糖、水楊酸、山梨酸、蔗糖、海藻糖和D-木糖產(chǎn)酸；V.P試驗(Voges-Proskauer test)、吲哚試驗、硝酸鹽還原等為陽性；能夠水解淀粉和酪蛋白。貝萊斯芽孢桿菌CR-14b和CR-502T菌株不能發(fā)酵D-松二糖，也不能水解DNA、吐溫20和吐溫80，但是能夠產(chǎn)生O-鄰硝基苯基β-D-吡喃半乳糖(O-nitrophenyl β-D-galactopyranoside，ONPG)。Ruiz-García等[3]發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌與其相近種在主要生理生化特征上的區(qū)別是該菌能夠利用糖原、乳糖、甲基α-D-糖苷和D-棉子糖產(chǎn)酸，不能利用D-松二糖產(chǎn)酸；該菌不能水解DNA、吐溫20和吐溫80，精氨酸雙水解酶為陰性，但是能夠產(chǎn)生ONPG。在胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptic soy agar，TSA)培養(yǎng)基上，貝萊斯芽孢桿菌能夠形成乳白色、粗糙、邊緣不規(guī)則的菌落；在TSB液體培養(yǎng)基中，液體表面會形成一層薄膜，液體內(nèi)混濁均勻。
經(jīng)典的分類學(xué)方法如形態(tài)和生理特征、細胞壁成分、16S rRNA基因序列、(G+C)mol%含量和脂肪酸甲酯(fatty acid methyl ester，F(xiàn)AME)等難以有效區(qū)分枯草芽孢桿菌復(fù)合群的物種(包括貝萊斯芽孢桿菌)。貝萊斯芽孢桿菌與其親緣關(guān)系相近的物種通過表型難以區(qū)分，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，保守基因或基因組序列進化分析被廣泛用于貝萊斯芽孢桿菌的物種鑒定。在分子水平上，基于16S rRNA基因序列進化分析結(jié)果顯示，貝萊斯芽孢桿菌CR-14b和CR-502T菌株與枯草芽孢桿菌枯草亞種(Bacillus subtilis subsp. subtilis)、解淀粉芽孢桿菌和死亡谷芽孢桿菌(Bacillus vallismortis)的親緣關(guān)系最近，序列相似性高達99%，高于物種劃分推薦的閾值> 98.65%。因此，僅僅通過16S rRNA基因序列分析不能有效區(qū)分貝萊斯芽孢桿菌與其相近種。近年來，更多的研究者通過保守基因gyrA、gyrB和rpoB等構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹來進一步確定貝萊斯芽孢桿菌的分類地位。
隨著測序技術(shù)的進步和測序費用的降低，越來越多的微生物基因組被公布，通過比較基因組學(xué)方法分析物種間的親緣關(guān)系逐漸成為主流。根據(jù)微生物基因組分類的描述，具有DDH (DNA-DNA hybridization)相似性(> 70%)、ΔTm (< 5 ℃)、全基因組(G+C)mol%含量差異(< 5%)、16S rRNA基因一致性(> 98%)被定義為同一種細菌。基于此，有學(xué)者將解淀粉芽孢桿菌植物亞種(Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum) FZB42T菌株重新歸類為貝萊斯芽孢桿菌。Dunlap等通過比較基因組學(xué)和in silico DNA-DNA雜交的方法對貝萊斯芽孢桿菌及其相近種進行了分類，認為貝萊斯芽孢桿菌不是解淀粉芽孢桿菌最近異模式的異名(a later heterotypic synonym)；甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)、解淀粉芽孢桿菌植物亞種和Bacillus oryzicola是貝萊斯芽孢桿菌的異名。近年來，有學(xué)者建議將枯草芽孢桿菌復(fù)合群分為4個支系，其中將解淀粉芽孢桿菌、植物相關(guān)的西姆芽孢桿菌(Bacillus siamensis)和貝萊斯芽孢桿菌(包含Bacillus methylotrophicus、B. velezensis和B. amyloliquefaciens subsp. plantarum)等細菌歸類第二支系(clade Ⅱ)，并建議將這些芽孢桿菌歸類為高于種分類水平但是低于枯草芽孢桿菌復(fù)合群分類單元的“Operational group B. amyloliquefaciens”中。隨著芽孢桿菌基因組序列的陸續(xù)公布、物種分類學(xué)技術(shù)方法的更新以及物種分類規(guī)則的多樣化，有些芽孢桿菌的物種分類地位也會相應(yīng)調(diào)整，這些芽孢桿菌種屬地位的變化也將更有利于研究者對其區(qū)分和理解。
二、主要抑菌物質(zhì)及其合成相關(guān)基因
芽孢桿菌在生長與繁殖過程中會產(chǎn)生許多具有抑菌活性的代謝產(chǎn)物，例如細菌素(bacteriocins)、伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)、二磷酸硫胺素、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、堿性蛋白酶、β-甘露聚糖酶和氨肽酶等。芽孢桿菌產(chǎn)生的多種活性肽對常見病原菌具有良好的抑制作用，是一種潛在的傳統(tǒng)抗生素替代品。貝萊斯芽孢桿菌通過合成次級代謝產(chǎn)物實現(xiàn)對病原菌的抑制作用，其中主要包括細菌素、抑菌蛋白、脂肽類物質(zhì)和聚酮化合物等。貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的細菌素類物質(zhì)主要有羊毛硫抗生素(lantibiotics)，因其含有如羊毛硫氨酸、甲基羊毛硫氨酸、脫氫丙氨酸等特殊的氨基酸而得名；抑菌蛋白主要有蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和β-葡聚糖酶等；脂肽類物質(zhì)主要有表面活性素、伊枯草菌素、泛革素(fengycin)、桿菌霉素等；聚酮類化合物主要有Macrolactin、Bacillaene、Difficidin等。貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽類物質(zhì)根據(jù)合成途徑可以分為核糖體合成肽和非核糖體合成肽。芽孢桿菌核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽通常被稱為細菌素，一般包括12?50個氨基酸殘基；根據(jù)核糖體合成之后是否經(jīng)過翻譯后修飾，將細菌素分為兩類：經(jīng)胞外修飾的細菌素Class Ⅰ和未經(jīng)修飾的細菌素Class Ⅱ。
非核糖體合成肽是指通過非核糖體肽合成酶(non-ribosomal peptide synthetase，NRPS)合成的，多發(fā)生于菌體生長停止之后，通過NRPS識別特定的氨基酸，經(jīng)過修飾如環(huán)化、酰基化、雜環(huán)化、甲基化和糖基化等過程，進而形成具有生物活性的分子肽。非核糖體合成肽根據(jù)其結(jié)構(gòu)的差異又可分為表面活性肽、伊枯草菌素和泛革素等三大家族，以及近年來發(fā)現(xiàn)的Maltacines復(fù)合物、親水性抗菌肽(bacilysin)、根霉素(rhizocticins)和Amicoumacins等。表面活性素、伊枯草菌素和泛革素都屬于脂肽類抗生素，一般由1個疏水脂肪烴鏈與由7?10個氨基酸組成的以酰胺鍵或內(nèi)酯鍵連接構(gòu)成的環(huán)肽，脂肪鏈的碳原子個數(shù)、氨基酸種類以及脂肪鏈與肽鏈連接方式的不同可形成不同的脂肽類型。其中，伊枯草菌素家族包括伊枯草菌素A、抗霉枯草菌素(mycosubtilin)、Bacilopeptins和桿菌霉素(bacillomycin) L、D、F。
貝萊斯芽孢桿菌抗菌肽類物質(zhì)的合成通常由多基因控制。Surfactin合成相關(guān)的基因簇是srfABCD，包含7個模塊，每個模塊負責(zé)一種氨基酸的識別和縮合；基因簇srfAB分別含有3個模塊，srfC含有1個模塊，srfC基因的末端連接1個Ⅱ型硫酯酶基因srfD，其與Surfactin的環(huán)化和釋放有關(guān)。此外，Surfactin的合成受到磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶編碼基因sfp的控制，枯草芽孢桿菌168菌株的sfp基因發(fā)生突變，則導(dǎo)致該菌株不能產(chǎn)生表面活性素。Fengycin是一種環(huán)脂肽類化合物，其合成酶的基因fenA、fenB、fenC、fenD和fenE共同構(gòu)成fen操縱子，它們分別編碼5個單體酶(FenA、B、C、D、E)，每個單體酶一般含1?3個氨基酸激活模塊，每個模塊具有識別特定氨基酸和形成相應(yīng)肽鍵的功能。Fengycin的合成從單體酶FenC開始，負責(zé)活化并組裝第1位和第2位氨基酸；然后經(jīng)過FenD、FenE和FenA分別負責(zé)活化第3?4、5?6和7?9位氨基酸；最后是單體酶FenB負責(zé)組裝最后一位氨基酸，并且具有釋放肽鏈的功能。伊枯草菌素是通過聚酮合酶(polyketide synthase，PKS)-NRPS雜合體系合成，編碼伊枯草菌素合成酶的基因ituD、ituA、ituB和ituC共同構(gòu)成itu操縱子。ituA編碼的蛋白與氨基脂肪酸的形成有關(guān)，負責(zé)組裝第1位氨基酸；ituB編碼具有4個氨基酸腺苷酸化結(jié)構(gòu)域的肽合成酶，負責(zé)組裝第2?5位氨基酸；ituC編碼含有2個腺苷酸化結(jié)構(gòu)域、1個差向異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域和硫酯酶結(jié)構(gòu)域的肽合成酶，有助于肽的環(huán)化，并且負責(zé)組裝第6和第7位氨基酸；ituD編碼丙二酰輔酶A轉(zhuǎn)酰酶，可調(diào)控伊枯草菌素的產(chǎn)量，與脂肪酸合成有關(guān)。桿菌霉素Bacillomycin D基因簇為bmyCBAD和xynD，全長約39.4 kb。Plantazolicin的生物合成是由12個基因組成的基因簇決定的，其基因簇大小約10 kb。Amylocyclicin是一種高度疏水的環(huán)肽，由6個基因組成的基因簇控制(約4.2 kb)。芽孢桿菌的溶桿菌素Bacilysin是一種非核糖體合成的由N末端L-丙氨酸殘基和C末端L-不典型的氨基酸殘基組成的二肽，其合成基因簇為bacABCDEFG，其中bacA編碼預(yù)苯酸脫羧酶、bacB編碼異構(gòu)/鳥苷?；D(zhuǎn)移酶、bacC編碼蛋白屬于氧化還原酶/還原酶家族、bacD編碼的是一種連接酶、bacE編碼的是大環(huán)內(nèi)酯輸出蛋白/透性酶、bacF編碼轉(zhuǎn)氨酶、bacG編碼的蛋白行使催化功能。綜上，貝萊斯芽孢桿菌抗菌肽類物質(zhì)的合成是由多基因控制的，這些基因通常是成簇出現(xiàn)在基因組上。隨著新的抗菌肽類物質(zhì)不斷發(fā)現(xiàn)，也將會有新的拮抗基因(簇)被鑒定，抑菌物質(zhì)的合成途徑也會被進一步闡釋。
三、拮抗和生防作用機制
拮抗芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌肽類物質(zhì)能夠造成細胞膜的損傷，破壞細菌細胞壁，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物外泄而殺滅細菌。例如：表面活性素能夠溶解和破壞細胞膜進而發(fā)揮抗菌活性；伊枯草菌素能夠引起細胞膜損傷，改變細胞的通透性，使細胞內(nèi)物質(zhì)外泄，進而達到抑菌目的；泛革素能夠降低真菌細胞膜表面的張力，形成微孔，促使K+和其他離子的滲漏，通過干擾和破壞細胞膜造成細胞死亡，對真菌具有較強的抗菌活性；Difficidin是多烯類抗生素，可抑制細菌的蛋白質(zhì)合成，破壞細胞膜的功能，具有廣泛的抗細菌活性。
貝萊斯芽孢桿菌主要通過分泌脂肽類抗生素、聚酮類化合物和抗菌蛋白等產(chǎn)生抑菌作用。Chowdhury等研究表明FZB42菌株(現(xiàn)已歸屬貝萊斯芽孢桿菌，下同)在與萵苣(lettuce)根系相互作用過程中能夠產(chǎn)生Surfactin、Fengycin和Bacillomycin D，并認為其代謝產(chǎn)物脂肽類和聚酮類物質(zhì)不僅直接抑制立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)，還能夠介導(dǎo)萵苣的防御性反應(yīng)；而且FZB42菌株產(chǎn)生的Surfactin和非核糖體合成的次級代謝產(chǎn)物能夠顯著提高萵苣防御素基因FDF1.2的表達量，尤其是在萵苣遇到病原菌侵染時。FZB42菌株產(chǎn)生的桿菌霉素Bacillomycin D對真菌具有顯著的抑制作用，能夠改變菌絲體和分生孢子細胞壁以及細胞質(zhì)膜的形態(tài)。劉雪嬌等發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌3A3-15能夠產(chǎn)生表面活性素(C14?C15 surfactin A)等抑菌物質(zhì)，該菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物能夠造成尖孢鐮刀菌的菌絲膨大、彎曲、纏繞、螺旋、節(jié)間縮短甚至菌絲斷裂等，具有明顯的致畸作用，而且對孢子萌發(fā)的抑制率高達93.2%。貝萊斯芽孢桿菌V4菌株能夠產(chǎn)生伊枯草菌素、Macrolactin和Difficidin等抗菌物質(zhì)，而且該菌株分泌的抑菌物質(zhì)能夠破壞殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)細胞膜的完整性，與細胞表面相互作用，細胞膜形成穿孔，造成細胞內(nèi)容物流失。貝萊斯芽孢桿菌Y6產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)(75 μg/mL)能夠抑制大約60%的真菌孢子萌發(fā)，其中伊枯草菌素對真菌孢子萌發(fā)表現(xiàn)出較強的抑制作用，泛革素表現(xiàn)出較弱的抗真菌活性，表面活性素則沒有明顯的抑制真菌活性。貝萊斯芽孢桿菌AP193菌株能夠產(chǎn)生聚酮類化合物Difficidin，其表達相關(guān)基因dfnD缺失后，缺失株ΔdfnD對病原菌(Pseudomonas syringe、Rhizobium radiobacter和Xanthomonas axonopodis等)的抑菌活性喪失，而且缺失株ΔdfnD對番茄細菌性斑點病沒有防控效果，認為Difficidin是貝萊斯芽孢桿菌AP193抑菌和生防作用中關(guān)鍵的次級代謝產(chǎn)物。
貝萊斯芽孢桿菌能夠產(chǎn)生拮抗蛋白類的抗菌物質(zhì)，如能夠降解細胞壁的幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶等。從番茄樹冠中分離的貝萊斯芽孢桿菌C2菌株能夠產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和β-葡聚糖酶，這些酶能夠降解真菌細胞壁中的蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和β-葡聚糖，進而起到抑菌作用。從黑胡椒根際中分離的貝萊斯芽孢桿菌RB.DS29產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)具有蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和β-葡聚糖酶活性，能夠破壞疫霉菌(Phytophthora)等真菌的細胞壁，對真菌病原具有良好的拮抗作用。
貝萊斯芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，提高植物抗病力，還能夠產(chǎn)生吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid，IAA)，促進植物生長。誘導(dǎo)植物抗性是芽孢桿菌生防作用的重要機制之一。誘導(dǎo)植物抗性是通過非致病菌株、弱毒菌株、蛋白質(zhì)或糖蛋白、胞外多糖和脂多糖等因子激活植物體內(nèi)苯丙氨酸解氨酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、幾丁質(zhì)酶和多酚氧化酶等防御酶，進而促使植物產(chǎn)生誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induce systemic resistance，ISR)，增強植物的抗病能力，抵御病原菌的入侵。例如，芽孢桿菌FZB24?產(chǎn)生一種信號蛋白誘導(dǎo)植物抗性蛋白的合成，增加植物的抗性，還可以通過分泌絲氨酸專性肽內(nèi)切酶直接誘導(dǎo)植物抗性。植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)可以通過JA/ET信號通路誘導(dǎo)植物ISR，通過活性氧暴發(fā)、細胞壁的強化、防御相關(guān)酶的累積以及抗菌物質(zhì)的產(chǎn)生等誘導(dǎo)植物細胞的防御反應(yīng)。此外，現(xiàn)已歸屬于貝萊斯芽孢桿菌的FZB42菌株產(chǎn)生的表面活性素和其他非核糖體合成的次級代謝產(chǎn)物可增強植物根系的防御性反應(yīng)。
由于物種確定的時間較短，貝萊斯芽孢桿菌的抑菌物質(zhì)分離純化的相關(guān)研究較少，目前主要是通過分析基因組中是否攜帶脂肽類、聚酮類等已知抗菌物質(zhì)相關(guān)基因(簇)以及蛋白酶、IAA等合成相關(guān)基因，并以此推測貝萊斯芽孢桿菌的抑菌作用及其生防作用潛力。在拮抗作用機制研究方面，由于貝萊斯芽孢桿菌通常分泌多種抑菌物質(zhì)，具體到特定抑菌物質(zhì)的生防作用，目前的研究尚不夠深入，建議構(gòu)建相關(guān)突變體深入分析抑菌物質(zhì)的生防效果。因此，今后應(yīng)加強貝萊斯芽孢桿菌抑菌物質(zhì)的分離純化及其抑菌作用機制研究，為進一步揭示其拮抗作用機理提供依據(jù)。
四、貝萊斯芽孢桿菌的應(yīng)用
1、在工業(yè)上的應(yīng)用潛力
蛋白酶是一種重要的生物酶，能夠有效水解蛋白質(zhì)，具有催化條件溫和、效率高、產(chǎn)生一些功能肽等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于食品、皮革、動物飼料、醫(yī)藥、環(huán)保和化工等行業(yè)。纖維素酶也是一種重要的工業(yè)酶。蛋白酶和纖維素酶在工業(yè)酶中占有很大的比例。研究發(fā)現(xiàn)，貝萊斯芽孢桿菌含有豐富的蛋白酶和纖維素酶，如從杜仲樹皮中分離的貝萊斯芽孢桿菌157菌株富含內(nèi)切纖維素酶、木聚糖酶、木質(zhì)素酶和果膠酶等酶類，其中內(nèi)切纖維素酶的產(chǎn)量最高，在飼料添加劑、洗滌劑和造紙領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。從巴西阿蒙盆地魚類腸道中分離的初步鑒定為貝萊斯芽孢桿菌的P11菌株具有顯著的角蛋白溶解活性、蛋白酶水解活性和纖維素酶活性，該菌在工業(yè)生產(chǎn)上具有巨大的應(yīng)用潛力。此外，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(現(xiàn)已歸屬于貝萊斯芽孢桿菌，下同) F35產(chǎn)生的抗菌肽對羅非魚片具有保鮮防腐效果，可使羅非魚肉冷藏保質(zhì)期延長4 d以上。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌FBKL1.0190分離自醬香型大曲中，因其產(chǎn)生高活性的中性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶和脂肪酶等，對提高醬香型大曲的品質(zhì)具有廣闊的應(yīng)用前景。貝萊斯芽孢桿菌SW5菌株能夠縮短魚露的發(fā)酵時間，增加風(fēng)味物質(zhì)的種類，可用于海洋蛋白質(zhì)源的發(fā)酵和深加工。
2、在動植物病害防控中的應(yīng)用
近年來，由于抗生素、消毒劑等化學(xué)藥物的長期使用，甚至是濫用導(dǎo)致耐藥菌的出現(xiàn)，嚴重威脅著人類的健康。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，化學(xué)農(nóng)藥的濫用使得動植物病原菌對藥物產(chǎn)生了耐藥性，導(dǎo)致病害防治難度增加，同時農(nóng)藥殘留也污染土壤、水體，破壞微生態(tài)平衡。拮抗益生菌如貝萊斯芽孢桿菌因其具有抑制病原菌、提高宿主免疫力、促進動植物生長等功能，廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的疫病防控。貝萊斯芽孢桿菌的來源非常豐富，如海水、底泥、土壤、植物根際和葉片、樹枝、水稻、小麥、玉米、蔬菜、昆蟲腸道、魚類腸道、動物糞便等。由于貝萊斯芽孢桿菌在不同生境中廣泛存在，為篩選不同生境中的優(yōu)良菌株提供了良好的條件，這也說明貝萊斯芽孢桿菌具有廣闊的應(yīng)用前景。
（1）在植物病害防控中的應(yīng)用
在植物病害防控方面，貝萊斯芽孢桿菌的生防作用表現(xiàn)尤為突出。貝萊斯芽孢桿菌能夠有效預(yù)防由子囊菌引起的植物真菌性病害，例如，從種植番茄的園藝大棚土壤中分離到對番茄早疫病原菌(Alternaria solani)和灰霉病原菌(Botrytis cinerea Pers.)等有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌S6，該菌的發(fā)酵液具有廣譜抑菌作用，發(fā)酵液原液和100倍稀釋液對番茄早疫病的田間防治效果分別為80.83%和64.88%。Sun等從梨園根際土壤中分離到一株對貝倫格葡萄座腔菌和粉紅單端孢菌等梨輪紋病菌具有抑制作用的拮抗貝萊斯芽孢桿菌L-1株，該菌不僅能夠在梨的傷口定殖，在皇冠梨接種該菌后第11天，對梨輪紋病的抑制率達到了76.55%，而且該菌能夠誘導(dǎo)梨的過氧化氫酶、過氧化物酶活性，延緩丙二醛的積累，并且對梨的品質(zhì)沒有影響，是一種對梨輪紋病非常具有應(yīng)用前景的生物防治劑。沙月霞等從水稻葉片中分離到一株對多種植物病原菌具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌E69，該菌能夠定殖在水稻莖部表皮、薄壁組織和維管束，而且對水稻葉瘟病的田間預(yù)防效果高達85.97%。曾欣等從溫郁金(Curcuma wenyujin)根莖中分離到一株具有拮抗活性的內(nèi)生細菌貝萊斯芽孢桿菌B-11，該菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、β-葡聚糖酶和嗜鐵素，同時產(chǎn)生伊枯草素、泛革素和表面活性素等3種脂肽類抗生素，生防實驗結(jié)果顯示該菌的發(fā)酵液對鐵皮石斛炭疽病的防治效率可達64%。遲惠榮等從多花黃精的根部分離出對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)具有拮抗作用的貝萊斯芽孢桿菌ZJU-3，該菌不僅能夠產(chǎn)生表面活性素、泛革素和伊枯草菌素等脂肽類化合物，而且可產(chǎn)生吲哚乙酸、激動素、玉米素和赤霉素等植物激素，該菌通過灌根對多花黃精具有顯著的促生長作用。
此外，貝萊斯芽孢桿菌對由疫霉菌和細菌引起的植物病害也有良好的生防作用。例如，Trinh等從黑胡椒根際中分離對疫霉菌具有拮抗活性的貝萊斯芽孢桿菌(RB.DS29株)，該菌不僅能夠促進植物生長，在溫室條件下RB.DS29菌株浸泡黑胡椒幼苗后能夠降低黑胡椒的發(fā)病率和死亡率。Cui等從馬鈴薯塊莖中分離到一株對引起馬鈴薯瘡痂病的病原鏈霉菌(Streptomyces galilaeus)具有較強抑菌活性的貝萊斯芽孢桿菌8-4株，田間試驗結(jié)果顯示該菌不僅能夠有效控制馬鈴薯瘡痂病的發(fā)病率，還能夠顯著提高馬鈴薯的產(chǎn)量。
已有研究表明貝萊斯芽孢桿菌對植物病原菌具有良好的拮抗作用，實驗室或者田間試驗結(jié)果顯示該菌對植物具有良好的生防效果，例如促進植物生長、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性以及降低植物病害的發(fā)生等。貝萊斯芽孢桿菌FZB42已經(jīng)被商業(yè)化應(yīng)用，作為生物肥料和生物防治劑在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域被廣泛使用。然而，目前絕大多數(shù)已分離的貝萊斯芽孢桿菌尚未規(guī)?；?、商業(yè)化應(yīng)用，因此，這些菌株在實際應(yīng)用中的生防效果尚需進一步驗證。截止2019年12月底，在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)(http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml)上可查詢到的農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)中，登記的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(現(xiàn)已被歸類為貝萊斯芽孢桿菌)有4條記錄，尚無貝萊斯芽孢桿菌的記錄，其中甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌LW-6 (登記證號：PD20181621)主要防治對象為柑橘樹潰瘍病、黃瓜細菌性角斑病和水稻細菌性條紋病，施用方法為噴霧。甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌9912 (登記證號：PD20181602)主要防治對象為黃瓜灰霉病，施用方法為噴霧。在應(yīng)用過程中，貝萊斯芽孢桿菌的菌株特性、作用對象以及使用劑型、方式、周期都將影響到其應(yīng)用效果。因此，不僅要加強貝萊斯芽孢桿菌抑菌產(chǎn)物的解析、抑菌機制和生防作用機制的研究，還要注重其生產(chǎn)工藝、產(chǎn)品劑型、使用方法和防治效果的研究。
（2）在動物病害防控中的研究與應(yīng)用
在動物病害防控方面，雖然貝萊斯芽孢桿菌的相關(guān)研究較少，但是依然表現(xiàn)出優(yōu)良的生防效果。在陸生動物病害防控方面，Nannan等從雞糞中分離到一株貝萊斯芽孢桿菌CN026，該菌對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、空腸彎曲桿菌和李斯特菌等食源性病原菌具有拮抗作用，而且CN026菌株的基因組中含有多種抑菌物質(zhì)的相關(guān)基因簇，這暗示該菌對預(yù)防雞的食源性病原菌具有較好的應(yīng)用潛力。在水生動物病害防控方面，Yi等從鯉魚腸道中分離到一株拮抗嗜水氣單胞菌、無乳鏈球菌和副溶血弧菌等水產(chǎn)常見病原菌的貝萊斯芽孢桿菌JW，該菌株飼喂鯽魚后，可增強鯽魚的體液免疫，提高鯽魚對嗜水氣單胞菌的抗病力。高艷俠等從羅非魚腸道中分離到一株拮抗多種水產(chǎn)動物病原菌的貝萊斯芽孢桿菌LF01，該菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有耐熱、耐酸堿、耐蛋白酶消化以及耐低溫儲藏等特性，而且對羅非魚、烏鱧和斑馬魚具有良好的生物安全性。在實驗室條件下，飼喂該菌后能夠顯著提高羅非魚的非特異性免疫，降低羅非魚腸道中愛德華氏菌屬和假單胞菌屬等潛在病原菌的豐度，增強羅非魚對無乳鏈球菌的抗病力。王金燕等從刺參養(yǎng)殖池塘的底泥中分離到一株貝萊斯芽孢桿菌DY-6，該菌對假交替單胞菌和多種弧菌等病原菌均有良好的抑制作用，而且對刺參具有良好的生物安全性，通過浸浴和投喂均可以降低刺參的發(fā)病率。王純研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌V4菌株具有拮抗病原菌的能力，飼喂虹鱒后可提高虹鱒存活率、增強機體免疫應(yīng)答和抗氧化應(yīng)激，而且V4菌株對虹鱒腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)無顯著影響。Li等從石斑魚腸道中分離出一株貝萊斯芽孢桿菌K2，該菌能夠拮抗多種水產(chǎn)常見病原菌，飼喂該菌后能夠誘導(dǎo)石斑魚某些免疫基因表達量的上調(diào)，增強石斑魚對哈維氏弧菌的抗病力。Thurlow等發(fā)現(xiàn)飼料中添加貝萊斯芽孢桿菌AP193菌株飼喂斑點叉尾鮰后，具有改善池塘水質(zhì)和促進生長的效果，同時能夠提高魚體對鮰愛德華氏菌的抗病力，但是尚未達到統(tǒng)計學(xué)顯著性水平。
目前，貝萊斯芽孢桿菌在動物病害防控中的應(yīng)用大多是在特定實驗條件下進行，這可能是因為動物能夠相對自由活動，考慮到貝萊斯芽孢桿菌應(yīng)用過程中的生物安全性，研究者通常沒有進行大規(guī)模示范與應(yīng)用，當(dāng)然這也與缺少商業(yè)化的菌株有關(guān)。貝萊斯芽孢桿菌在動物病害防控方面的研究尚局限于分離特定生境中的優(yōu)良微生物資源、分析優(yōu)良菌株的生物學(xué)特性及其應(yīng)用潛力，到大規(guī)模的應(yīng)用還需深入研究和系統(tǒng)評價。
五、總結(jié)與展望
貝萊斯芽孢桿菌作為生防細菌是近年來的研究熱點，尤其是當(dāng)其分類地位被確定以后。2016年以來，貝萊斯芽孢桿菌引起了研究者的廣泛關(guān)注，發(fā)表的相關(guān)研究論文、專利呈現(xiàn)快速增長態(tài)勢，其中相關(guān)研究主要集中在植物促生長和病害防控、食品發(fā)酵和加工應(yīng)用、環(huán)境保護、動物飼料、水產(chǎn)養(yǎng)殖以及基因組測序和功能基因分析等方面。貝萊斯芽孢桿菌作為生防制劑具有廣闊的應(yīng)用前景：(1)主要用于植物根際和葉面的共生菌，促進植物生長，抑制病原菌的侵染，誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性；(2)用于降低養(yǎng)殖動物腸道和生境中的病原菌豐度，降低發(fā)病率，減少化學(xué)藥物使用量；(3)用于新型藥物的開發(fā)與利用，篩選新型生物抗菌劑替代傳統(tǒng)化學(xué)藥物；(4)用于制備蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等酶制劑，提高工業(yè)生產(chǎn)效率等。
1、存在問題和解決對策
目前，貝萊斯芽孢桿菌因其優(yōu)良的生防作用在農(nóng)業(yè)病蟲害防控方面引起了廣泛關(guān)注，但是國內(nèi)外關(guān)于貝萊斯芽孢桿菌的研究主要集中在菌株的分離鑒定、抑菌活性分析以及初步應(yīng)用示范等階段，在研究及其應(yīng)用方面存在一些問題，主要體現(xiàn)在以下幾個方面：
(1)優(yōu)良種質(zhì)資源篩選。貝萊斯芽孢桿菌作為拮抗菌株已被大量分離和鑒定，但是仍然不能滿足當(dāng)前人們對動植物生防制劑的需求。目前，農(nóng)作物領(lǐng)域中貝萊芽孢桿菌的種質(zhì)資源相對豐富，急需豐富動物源貝萊斯芽孢桿菌的種質(zhì)資源庫。在實際應(yīng)用過程中，貝萊斯芽孢桿菌易受到宿主、氣候、土壤、水質(zhì)等多種因素的影響，干擾菌株的生長繁殖進而影響其生防效果。而且，由于抗生素、殺蟲劑、消毒劑等藥物的使用，土壤、水體、底泥和宿主中存在化學(xué)藥物的殘留和累積，會降低貝萊斯芽孢桿菌的作用效果，也會造成菌株產(chǎn)生耐藥性風(fēng)險。此外，由于一些貝萊斯芽孢桿菌對高濃度的重金屬較為敏感，水體、土壤、肥料、飼料中的重金屬污染也會削弱貝萊斯芽孢桿菌在病害防控中的應(yīng)用效果。因此，篩選適應(yīng)特定生境的優(yōu)良菌株尤為必要。
(2)生防作用機制研究。貝萊斯芽孢桿菌產(chǎn)生的具有抑菌活性的次級代謝產(chǎn)物種類豐富、穩(wěn)定性好、抗菌譜廣。然而，貝萊斯芽孢桿菌在與宿主相互作用時分泌的抑菌物質(zhì)有哪些，這些抑菌物質(zhì)激發(fā)宿主的主要免疫應(yīng)答是什么等機制尚不清楚。建議通過分子遺傳操作構(gòu)建突變株，定向研究某一種或某一類抑菌物質(zhì)對宿主的生防作用，再利用多組學(xué)分析貝萊斯芽孢桿菌與宿主相互作用時的應(yīng)答機制。
(3)貝萊斯芽孢桿菌的定殖能力。定殖能力是益生菌篩選的重要指標(biāo)之一，拮抗益生菌能夠在動物腸道和植物的根際、莖、葉片中定殖，可形成種群優(yōu)勢，有效減少益生菌的使用劑量和使用頻率。一些植物內(nèi)生貝萊斯芽孢桿菌因其具有良好的定殖能力，可提高菌株的生防效果。然而，貝萊斯芽孢桿菌定殖機理的研究報道較少，因此應(yīng)加強這方面的相關(guān)研究，如：構(gòu)建熒光標(biāo)記菌株，通過熒光示蹤方法分析貝萊斯芽孢桿菌在植物根、葉圍等部位以及動物腸道中的定殖能力；挖掘與定殖相關(guān)基因(簇)，通過分子遺傳改良技術(shù)增強菌株的定殖能力，提高其應(yīng)用價值。
(4)貝萊斯芽孢桿菌的生物安全性。雖然貝萊斯芽孢桿菌作為拮抗益生菌具有巨大的應(yīng)用潛力，但是其生物安全評價相關(guān)的研究較少，應(yīng)加強其生物安全評估，例如貝萊斯芽孢桿菌本身對應(yīng)用對象的致病性、次級代謝產(chǎn)物對作用對象的安全性以及使用貝萊斯芽孢桿菌后對生態(tài)環(huán)境的影響等，這也是今后貝萊斯芽孢桿菌走向商業(yè)化應(yīng)用的必經(jīng)之路。
(5)貝萊斯芽孢桿菌的規(guī)?；蛏虡I(yè)化應(yīng)用。雖然貝萊斯芽孢桿菌在生物防治、藥物研發(fā)、食品發(fā)酵和工業(yè)酶制劑等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景，但是尚未進行規(guī)?；蛏虡I(yè)化應(yīng)用。因此，應(yīng)更加注重優(yōu)良菌株的篩選和改良、生產(chǎn)工藝的優(yōu)化及生防作用的生產(chǎn)性試驗，讓貝萊斯芽孢桿菌盡快走向產(chǎn)業(yè)化、商業(yè)化。
2、展望
隨著人們對食品安全的重視和環(huán)保意識的提高，迫切需要符合現(xiàn)代社會發(fā)展需要的生物農(nóng)藥。貝萊斯芽孢桿菌因其無殘留、無致病性、環(huán)境友好而且能夠提高動植物生長性能和抗病力，日益受到學(xué)者們的青睞。我們認為在今后的研究中，應(yīng)注重挖掘貝萊斯芽孢桿菌的功能基因(簇)，并通過基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)等大數(shù)據(jù)解析功能基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入研究貝萊斯芽孢桿菌與宿主的相互作用機制，加強貝萊斯芽孢桿菌生物活性物質(zhì)的分離純化和開發(fā)利用，重視貝萊斯芽孢桿菌的生物安全性評估研究等。貝萊斯芽孢桿菌對農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，相信貝萊斯芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品和環(huán)境等領(lǐng)域?qū)⒑芸彀l(fā)揮重要作用。
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