一、背景
大鼠睪丸支持細胞又稱Sertoli細胞，是生精細胞的支架，為其提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，能合成與分泌雄激素結(jié)合蛋白，為其提供高濃度的雄激素環(huán)境等，還具有構(gòu)成血-睪屏障，形成睪丸內(nèi)微環(huán)境，調(diào)節(jié)精子發(fā)生等功能。
睪丸支持細胞是存在于雄性睪丸間質(zhì)中的主要細胞類型，其主要功能是分泌和合成睪丸酮，睪丸酮在刺激精子發(fā)生、精子成熟及性功能的維持等方面具有重要作用。目前，以睪丸支持細胞為靶向的藥物研究備受關(guān)注。體外培養(yǎng)的睪丸支持細胞能直接反應(yīng)藥物對該細胞作用的特點，使分離純化睪丸支持細胞成為必要的前提條件。
二、大鼠睪丸支持細胞培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?0cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。**天換液并檢查細胞密度。
2）大鼠睪丸支持細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）大鼠睪丸支持細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。
下面T25瓶為類；
1、細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。
2、4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細胞懸液，注意凍存管做好標識。
3、將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
大鼠睪丸支持細胞可以用于妊娠期鎘暴露對父系子代大鼠睪丸支持細胞的影響及相關(guān)基因DNA甲基化作用的研究：
妊娠期鎘暴露對子代大鼠睪丸支持細胞的影響目的:妊娠期鎘暴露對子代大鼠睪丸支持細胞的影響。
方法：清潔級SD大鼠250±10g,雌雄1:1或1:2合籠飼養(yǎng),次日清晨檢查陰栓或進行陰道涂片檢查,發(fā)現(xiàn)陰栓或涂片發(fā)現(xiàn)精子記為妊娠期第0天,將孕鼠(F0代)隨機分成4組,氯化鎘(0、0.5、1、2mg/kg/day)灌胃染毒,染毒時間為妊娠天直至分娩(即1-21天)。
F0代孕鼠自然分娩產(chǎn)下F1代雄鼠,常規(guī)喂養(yǎng)至5、21和56天(PND5、PND21、PND56)后,隨機抽取每組F1代成年雄鼠與外來健康的雌鼠1:2合籠交配產(chǎn)生F2代,F2代雄鼠常規(guī)喂養(yǎng)后以同樣的方式產(chǎn)生F3代成年雄鼠。
收集F1、F2及F3代血清和睪丸,行組織病理學(xué)檢查,經(jīng)H&E染色后進行曲細精管(Seminiferous Tubule,ST)直徑測量及Johnsen評分評價睪丸生長發(fā)育情況;透射電鏡觀察細胞超微結(jié)構(gòu);ELISA方法測定血清中促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,Gn RH)、卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)激素水平;免疫組織化學(xué)方法進行睪丸組織細胞FSHR定位及表達量檢測。
結(jié)果：1、妊娠期鎘暴露對子代大鼠生長發(fā)育和睪丸組織病理學(xué)的影響
1.1基礎(chǔ)數(shù)據(jù)顯示:與對照組相比,F1代大鼠體重僅在PND5時,2mg/kg劑量組體重增加(P<0.05);F2代大鼠體重僅在PND21時,1mg/kg劑量組體重增加(P<0.05)。
1.2 H&E染色顯示:F1代大鼠睪丸僅在PND5時,1mg/kg劑量組睪丸曲細精管直徑減少(P<0.05);F2代大鼠睪丸僅在PND56時,0.5mg/kg劑量組睪丸曲細精管直徑減少(P<0.05),在2mg/kg睪丸曲細精管直徑增加(P<0.05);F3代大鼠睪丸0.5mg/kg曲細精管直徑增加(P<0.05),其他各個劑量組Johnsen評分增加(P<0.05);光學(xué)顯微鏡下顯示三代各時期睪丸支持細胞未見異常變化,曲細精管內(nèi)均可見完好精子發(fā)生。
2、妊娠期鎘暴露對子代睪丸支持細胞超微結(jié)構(gòu)的影響透射電鏡顯示在F1代大鼠PND5、PND56睪丸支持細胞在對照組細胞膜完整、核膜完整與周圍細胞聯(lián)系緊密,劑量組觀察到睪丸支持細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)改變,出現(xiàn)明顯空泡化、水腫、壞死,并與周圍細胞間隙增大。
3、妊娠期鎘暴露對雄性子代血清激素的影響血清激素水平檢測顯示:F1代結(jié)果:Gn RH在PND21,0.5mg/kg水平發(fā)生上升(P<0.05)。FSH在PND5時0.5mg/kg水平上升(P<0.05);在PND21時各個劑量組血清中FSH水平下降(P<0.05)。F2代結(jié)果:FSH在PND5,0.5mg/kg水平上升(P<0.05)。F3代結(jié)果:Gn RH、FSH在F3代未見明顯變化。
4、妊娠期鎘暴露對子代睪丸支持細胞分泌FSHR蛋白的影響妊娠期鎘暴露后F1代PND56睪丸組織經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后觀察到支持細胞分布在曲細精管基底面,未見游離支持細胞,正常組FSHR分布于基底面,蛋白AOD值為0.5090,劑量組FSHR蛋白同樣分布于曲細精管基底面,蛋白AOD值為0.4011,與對照組相比,FSHR蛋白AOD值降低(P<0.05)。
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