一、背景
TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系是由湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院建立，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在RPMI＋15％小牛血清的培養(yǎng)液中。TSCCa細(xì)胞系是被HELA污染的細(xì)胞系。
二、TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系培養(yǎng)操作
1）復(fù)蘇TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2）TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.將細(xì)胞懸液按1：2比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。
3）TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為類；
1.細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入1ml含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。
2.4 min 1000rpm離心去掉上清。加1ml血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和DMSO，輕輕混勻，DMSO終濃度為10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存1ml細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
3.將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80度冰箱，2個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系可以用于轉(zhuǎn)染IL-18基因聯(lián)合二萜生物堿對(duì)舌鱗癌細(xì)胞Tscca的增殖抑制與促凋亡作用：
構(gòu)建白介素-18(IL-18)真核表達(dá)載體,通過轉(zhuǎn)染技術(shù)將IL-18基因轉(zhuǎn)染入TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系,同時(shí)分別加入不同濃度的二萜生物堿(DA),分別采用流式細(xì)胞術(shù)、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡與增殖抑制情況,最后通過檢測(cè)Akt/p-Akt通路探究IL-18聯(lián)合二萜生物堿對(duì)TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系可能凋亡機(jī)制。
方法：
1、根據(jù)Gen Bank中IL-18 DNA序列,設(shè)計(jì)并合成IL-18基因特異性引物;
2、提取人新鮮血液中單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC),提PBMC的總RNA,RT-PCR方法獲得其c DNA,PCR擴(kuò)增目的片段,構(gòu)建PEGFPN3-IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)酶切和測(cè)序均鑒定正確后瞬時(shí)轉(zhuǎn)染TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率;
3、DMSO溶解二萜生物堿,調(diào)整其濃度為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml;4、MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)空白對(duì)照組(未處理Tscca細(xì)胞)、IL-18組(僅轉(zhuǎn)染IL-18)、單獨(dú)二萜生物堿組(分為0.2 mg/ml、0.4 mg/ml、0.6 mg/ml 3組)及聯(lián)合組(分為IL-18+0.2 mg/ml、IL-18+0.4 mg/ml、IL-18+0.6 mg/ml 3組)對(duì)TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系生長(zhǎng)的影響與細(xì)胞凋亡情況;5、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶Akt/p-Akt的蛋白水平,分析IL-18聯(lián)合二萜生物堿是否在此條通路發(fā)揮一定作用從而抑制TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系的增殖。
結(jié)果：
1、成功構(gòu)建PEGFPN3-IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒;
2、成功轉(zhuǎn)染舌鱗癌細(xì)胞,且熒光鏡下觀察轉(zhuǎn)染PEGFPN3-IL-18真核表達(dá)質(zhì)粒的TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡增加;
3、二萜生物堿濃度為0.2、0.4、0.6 mg/ml時(shí),隨濃度增大TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凋亡增多,且均有p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
4、IL-18與二萜生物堿聯(lián)合對(duì)Tscca細(xì)胞作用48 h后,較單獨(dú)使用二萜生物堿抑制作用明顯,且呈濃度依賴性,均有p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5、IL-18聯(lián)合二萜生物堿還可劑量依賴性地降低p-Akt的蛋白水平,各組均有p<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而總Akt水平幾乎不變。
結(jié)論：
1、二萜生物堿對(duì)TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞有增殖抑制及促凋亡作用,且呈濃度依賴性;
2、IL-18聯(lián)合二萜生物堿對(duì)TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系有協(xié)同抑制作用,且抑制作用較單獨(dú)使用IL-18或二萜生物堿均較強(qiáng);
3、IL-18聯(lián)合二萜生物堿在抑制p-Akt的表達(dá)及活化這條信號(hào)通路上發(fā)揮一定作用從而抑制TSCCA人舌鱗癌貼壁細(xì)胞系的增殖并促進(jìn)其凋亡。
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