馬梭菌PCR試劑盒的成分與應(yīng)用及使用方法！
小楊 / 2024-01-09 08:55:21
一、背景
馬梭菌PCR試劑盒是一種用于檢測馬梭菌感染的PCR試劑盒。馬梭菌(Clostridium difficile)是一種常見的腸道細(xì)菌，可引起嚴(yán)重的腹瀉和腸炎。PCR(聚合酶鏈反應(yīng))是一種高度敏感和特異性的分子生物學(xué)技術(shù)，可用于檢測病原體的DNA或RNA。
引物：用于擴增馬梭菌特異性基因的一對寡核苷酸序列。
緩沖液：用于維持PCR反應(yīng)所需的離子濃度和pH值。
dNTPs:為PCR反應(yīng)提供合成DNA所需的原料。
Taq DNA聚合酶：用于擴增目標(biāo)DNA片段。
鎂離子：為Taq DNA聚合酶提供反應(yīng)所需的鎂離子。
標(biāo)準(zhǔn)品：用于定量檢測馬梭菌感染的程度。
使用
馬梭菌PCR試劑盒進(jìn)行檢測時，首先需要提取樣本中的DNA，然后將提取的DNA與引物混合，進(jìn)行PCR反應(yīng)。通過檢測PCR產(chǎn)物的特異性條帶，可以確定是否存在馬梭菌感染。此外，還可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對樣本中的馬梭菌數(shù)量進(jìn)行定量分析。
使用馬梭菌PCR試劑盒，可以在較短時間內(nèi)將馬梭菌的DNA進(jìn)行大量擴增，從而對其進(jìn)行檢測。這種試劑盒具有高靈敏度和高特異性，可以準(zhǔn)確地檢測出馬梭菌的存在。
需要注意的是，PCR技術(shù)雖然靈敏度高、特異性好，但也存在一些假陽性或假陰性結(jié)果的可能。因此，在使用PCR試劑盒進(jìn)行檢測時，需要結(jié)合其他檢測方法，如培養(yǎng)法、血清學(xué)檢測等，以提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。同時，由于不同種類的馬梭菌可能具有不同的DNA序列，因此在使用試劑盒時需要注意選擇適合的引物和程序，以確保檢測的準(zhǔn)確性。
三、應(yīng)用
以純血馬和不同飼養(yǎng)條件下的蒙古馬新鮮糞便為實驗樣品,用生物試劑盒直接從糞樣中提取細(xì)菌基因組DNA,使用馬梭菌PCR試劑盒PCR技術(shù)從細(xì)菌總DNA中擴增出16SrDNA V3區(qū)序列并采用變性梯度凝膠電泳分離不同細(xì)菌的基因序列。用Quantity One軟件對膠圖進(jìn)行分析,同時切膠回收優(yōu)勢條帶進(jìn)行克隆測序。將得到的測序在基因庫數(shù)據(jù)里進(jìn)行Blast比對判斷菌種屬性。
實驗主要結(jié)果以下：
第一、蒙古馬和純血馬腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較中,DGGE膠圖顯示不同位置的條帶有53個。選擇41個優(yōu)勢條帶回收測序鑒定中與NCBI數(shù)據(jù)庫細(xì)菌16S rDNAV3區(qū)序列相似性96%以上的僅有16個克隆。在蒙古馬兩種不同飼養(yǎng)條件下的腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)變化的研究中,馬梭菌PCR試劑盒DGGE膠圖中顯示共有50個條帶,選40個優(yōu)勢條帶回收測序,結(jié)果序列相似性96%以上有17個克隆。因此同源性較低。兩次實驗中分別未報道的優(yōu)勢細(xì)菌占總細(xì)菌的約61%和58%。
第二、利用Quantity One軟件分析出的DGGE圖譜識別的條帶數(shù)目和群落多樣性指標(biāo)來看,純血馬腸道優(yōu)勢菌比蒙古馬腸道優(yōu)勢菌更豐富多樣。聚類分析結(jié)果蒙古馬和純血馬各自聚成一支,品種之間腸道優(yōu)勢菌相似性僅為0.33。品種內(nèi)相似性都大于品種間相似性。蒙古馬7月份草原上放牧?xí)r的腸道優(yōu)勢菌比3月份圈養(yǎng)時的腸道優(yōu)勢菌更豐富多樣。聚類分析后蒙古馬3月份和7月份各自聚成一支,之間相似性為0.54。蒙古馬吃干草情況下的種內(nèi)相似性大于吃青草時的。
第三、使用馬梭菌PCR試劑盒鑒定蒙古馬和純血馬腸道內(nèi)共有的優(yōu)勢菌有棲瘤胃普雷沃氏菌、溶纖維丁酸弧菌、微黃棒狀桿菌、黃化瘤胃球菌和枯草芽孢桿菌,以上菌種中除了枯草芽孢桿菌都具有降解纖維功能?？莶菅挎邨U菌是多功能益生菌。蒙古馬腸道內(nèi)特有的優(yōu)勢菌有瘤胃球菌屬、解纖維梭菌、化糖梭狀芽胞桿菌。其中前兩者是較強的纖維降解菌。純血馬腸道內(nèi)特有的優(yōu)勢菌有巴氏梭狀芽胞桿菌、嗜胺梭菌、氧化還原真桿菌、活潑瘤胃球菌、共生梭菌、乳酸雙歧桿菌、牛鏈球菌、炭疽芽孢桿菌。蒙古馬7月份草原上放牧比3月份圈養(yǎng)條件,腸道內(nèi)新增優(yōu)勢菌有解纖維醋弧菌、直腸真桿菌、梭狀梭菌、一致糞球菌、短真桿菌。相反微黃棒狀桿菌和枯草芽孢桿菌在蒙古馬放牧吃青草情況下變成不是優(yōu)勢條帶。蒙古馬兩種不同飼養(yǎng)條件下腸道主要纖維菌的種類變化不大。
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