犬流感病毒通用PCR試劑盒的應用及研究動態(tài)！
小楊 / 2024-01-22 08:45:48
一、背景
犬流感病毒通用PCR試劑盒是一種用于檢測犬流感病毒的實驗工具，采用聚合酶鏈式反應（PCR）技術進行檢測。該試劑盒具有高靈敏度和特異性，能夠快速、準確地檢測出犬流感病毒，對于該病的診斷和治療具有重要意義。
犬流感病毒是一種常見的病毒，可引起犬類呼吸道感染。該病毒可以通過直接接觸感染犬或接觸污染的環(huán)境進行傳播。感染犬流感病毒的犬可能會出現(xiàn)咳嗽、流鼻涕、高熱等癥狀，嚴重時可能導致肺炎和死亡。因此，對犬流感病毒進行快速、準確的檢測對于控制該病的傳播和預防具有重要意義。
犬流感病毒通用PCR試劑盒的組成通常包括一對引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs等必要的PCR反應成分，以及可能包含的各種成分如染料、緩沖液、特異性結(jié)合探針等。引物是PCR反應的關鍵成分，它們與犬流感病毒基因的特定區(qū)域結(jié)合，從而啟動DNA的擴增過程。Taq DNA聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶，能夠催化DNA的合成。dNTPs是合成DNA的基本原料。
使用犬流感病毒通用PCR試劑盒進行檢測時，首先需要采集感染犬流感病毒的樣本，如鼻拭子或咽拭子等。將樣本中的DNA或RNA與試劑盒中的引物和Taq DNA聚合酶等成分混合，進行PCR反應。反應過程中，DNA或RNA會不斷擴增，最終形成大量的特定基因片段。通過凝膠電泳等技術對這些片段進行分析，可以判斷出是否存在犬流感病毒基因，從而確定犬是否感染該病原體。
1、樣本采集：從患者體內(nèi)采集血液、糞便、組織等樣本，并將其保存在無菌容器中。
2、DNA提取：將采集到的樣本進行DNA提取，通常采用柱式或磁珠式DNA提取試劑盒。提取后的DNA應保存在-20°C或更低的溫度下。
3、PCR反應體系準備：根據(jù)犬流感病毒通用PCR試劑盒的要求，配制PCR反應體系，包括引物、熒光探針、dNTPs、DNA聚合酶等。
4、PCR反應：將提取的DNA加入到PCR反應體系中，進行PCR反應。反應條件和時間根據(jù)試劑盒說明書的要求進行設置。
5、結(jié)果分析：將PCR反應后的產(chǎn)物進行熒光信號檢測，根據(jù)熒光信號的出現(xiàn)情況判斷是否存在犬流感病毒的感染。
三、應用
以流感病毒高度保守的M1蛋白為靶標,通過噬菌體抗體庫篩選特異性抗M1蛋白的scFv,并對scFv進行免疫結(jié)合活性和生物學活性研究;然后將利用具有高效跨膜轉(zhuǎn)導功能的TAT蛋白構建TAT-scFv穿梭胞內(nèi)抗體,在細胞水平和SPF雞胚中評價胞內(nèi)抗體對A/Canine/Guangdong/05/2011(H3N2)、A/Duck/Guangdong/W12/2011(H3N2)和A/Beijing/1/1968(H3N2)三株異源流感病毒增殖的影響。
1、H3N2犬流感病毒M1蛋白的原核表達及鑒定為制備犬流感病毒(H3N2)M1蛋白純品,針對H3N2犬流感病毒M1蛋白高度保守序列設計引物,犬流感病毒通用PCR試劑盒PCR擴增目的基因片段,擴增產(chǎn)物克隆至表達載體pET-SUMO中并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3),誘導表達目的蛋白,探索純化工藝,制備目的蛋白,Western blot檢測純化的M1蛋白。通過犬流感病毒通用PCR試劑盒PCR成功擴增出大小為771bp的M1基因,成功構建pET-SUMO-M1表達質(zhì)粒,經(jīng)酶切純化后獲得M1蛋白純品,為進一步制備通用型抗H3N2犬流感病毒抗體提供純品抗原。
2、抗H3N2犬流感病毒M1蛋白scFv的篩選及活性研究以M1為靶蛋白,采用固定相篩選法同時從噬菌體抗體庫Tomlinson I庫(庫容量:1.47×108)和Tomlinson J庫(庫容量:1.37×108)中篩選抗M1蛋白的單鏈抗體,進行四輪生物淘洗后,顯示每增加一輪篩選高親和力陽性噬菌體克隆富集倍數(shù)都有所提高。通過間接ELISA法和犬流感病毒通用PCR試劑盒PCR鑒定篩選陽性菌株,最終獲得C2菌株與M1靶蛋白的免疫結(jié)合活性最顯著,對C2菌株抗體基因進行分析,具有完整的單鏈抗體結(jié)構。C2菌株擴大培養(yǎng)并成功純化出H3N2-scFv純品,BCA檢測蛋白濃度為1.6mg/mL,薄層掃描顯示純度為98.9%,利用WB法對純化的scFv進行鑒定,結(jié)果顯示制備的scFv和M1靶蛋白具有良好的免疫結(jié)合活性。在細胞水平和SPF雞胚模型中生物學活性研究顯示,scFv在濃度高達1.6mg/mL對細胞和雞胚沒有顯著的毒性作用,對A/Canine/Guangdong/05/2011(H3N2)株犬流感病毒復制具有顯著的抑制作用,呈現(xiàn)劑量依賴性特征,細胞水平IC50=0.290mg/mL,雞胚水平IC50=0.120mg/mL,證明在雞胚中,scFv的靈敏度更高。
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