AtT20（小鼠垂體瘤細(xì)胞）的培養(yǎng)操作及應(yīng)用！
小楊 / 2024-02-21 08:49:56
一、背景
AtT20是一種來源于小鼠垂體腺瘤的細(xì)胞系，常用于研究垂體腺瘤的生物學(xué)特性、藥物篩選和治療策略。該細(xì)胞系具有以下特點(diǎn)：
來源：
AtT20細(xì)胞系來源于小鼠垂體腺瘤組織，經(jīng)過多次傳代和篩選，形成了一個(gè)相對穩(wěn)定的細(xì)胞系。
形態(tài)特征：AtT20細(xì)胞呈多邊形或長條形，大小約為15-30微米，胞質(zhì)豐富，核大而圓，核仁明顯。
生長特性：AtT20細(xì)胞生長迅速，傳代周期約為24-48小時(shí)，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。
激素分泌特性：AtT20細(xì)胞具有垂體腺瘤的典型激素分泌特性，如生長激素、促甲狀腺激素等，可用于研究垂體腺瘤相關(guān)的激素分泌異常。
其他特性：AtT20細(xì)胞還具有一定的增殖能力，可用作研究垂體腺瘤細(xì)胞增殖相關(guān)疾病的模型。
1)復(fù)蘇AtT20細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)AtT20細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)AtT20細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
AtT20可以用于丙戊酸鈉聯(lián)合替莫唑胺對小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1凋亡的促進(jìn)作用及其機(jī)制研究：
探討替莫唑胺聯(lián)合丙戊酸鈉對小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1增殖的抑制作用以及凋亡的促進(jìn)作用,并探討其可能的分子機(jī)制。
方法：
1、細(xì)胞培養(yǎng):小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1培養(yǎng)于含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/High Glucose培養(yǎng)基中,放置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),視細(xì)胞生長狀態(tài),間隔約1-2天半量換液一次,3天左右1:3傳代一次。取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2、TMZ與VPA對AtT20、GT1-1細(xì)胞增殖的影響。取對數(shù)生長期的AtT20、GT1-1細(xì)胞,將細(xì)胞分為(1)AtT20細(xì)胞TMZ組:向細(xì)胞中分別加入不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mM)TMZ,并分別培養(yǎng)24、48、72h;(2)AtT20細(xì)胞VPA組:向細(xì)胞中分別加入不同濃度(2、4、8、16、32、64mM)VPA,并分別培養(yǎng)24、48、72h;(3)GT1-1細(xì)胞TMZ組:向細(xì)胞中分別加入不同濃度TMZ(濃度同前),并分別培養(yǎng)24、48、72h;(4)GT1-1細(xì)胞VPA組:向細(xì)胞中分別加入不同濃度VPA(濃度同前),并分別培養(yǎng)24、48、72h,通過CCK-8法檢測TMZ與VPA各自對AtT20、GT1-1細(xì)胞增殖的影響。
3、TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1細(xì)胞活性的影響。取對數(shù)生長期的AtT20、GT1-1細(xì)胞,將細(xì)胞分為(1)對照組(加入等量完全培養(yǎng)基);(2)TMZ組(加入1.6mMTMZ);(3)VPA組(加入16mMVPA);(4)TMZ+VPA組(加入1.6mM TMZ以及加入16mM VPA)。藥物處理72h后,通過LDH法檢測TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對AtT20、GT1-1細(xì)胞活性的影響。
4、TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1細(xì)胞凋亡的影響。取對數(shù)生長期的AtT20、GT1-1細(xì)胞,按照上述分組,分別給予完全培養(yǎng)基、TMZ以及VPA,藥物處理72h后,通過TUNEL染色、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對AtT20、GT1-1細(xì)胞凋亡的影響;通過Hoechst 33258染色檢測TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對AtT20、GT1-1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。
5、TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1細(xì)胞凋亡影響的分子機(jī)制。取對數(shù)生長期的AtT20、GT1-1細(xì)胞,按照上述分組,分別給予完全培養(yǎng)基、TMZ以及VPA,藥物處理72h后,通過Western blot檢測TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對AtT20、GT1-1細(xì)胞cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、Bax、Bcl-2、AIF、cleaved PARP、p53等凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響。
結(jié)果：
1、TMZ與VPA對AtT20、GT1-1細(xì)胞增殖的影響。CCK-8法檢測結(jié)果顯示:TMZ、VPA分別作用于AtT20、GT1-1細(xì)胞后,細(xì)胞增殖與對照組相比明顯抑制且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),TMZ、VPA對細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用,且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性與時(shí)間依賴性。
2、TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1細(xì)胞活性的影響。LDH法檢測結(jié)果顯示:TMZ、VPA分別作用于AtT20、GT1-1細(xì)胞后,細(xì)胞活性與對照組相比明顯降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05),TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞活性進(jìn)一步降低,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
3、TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用對小鼠垂體腺瘤細(xì)胞AtT20、GT1-1細(xì)胞凋亡的影響。TUNEL染色、流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示:TMZ、VPA分別作用于AtT20、GT1-1細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡水平與對照組相比顯著升高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用后細(xì)胞凋亡水平進(jìn)一步升高,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示:TMZ、VPA分別作用于AtT20、GT1-1細(xì)胞后,表現(xiàn)為均勻彌散染色的細(xì)胞核(活細(xì)胞核)數(shù)量減少,濃染致密的顆粒塊狀熒光(凋亡細(xì)胞核)數(shù)量增多,細(xì)胞凋亡水平與對照組相比顯著升高,TMZ與VPA聯(lián)合應(yīng)用后凋亡水平進(jìn)一步升高。
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