蜂房小甲蟲PCR試劑盒的特點與應(yīng)用及操作步驟！
小楊 / 2024-02-20 08:59:51
一、背景
蜂房小甲蟲PCR試劑盒是一種用于檢測蜂房小甲蟲的生物試劑，具有高特異性、高靈敏度和高重現(xiàn)性等特點。
蜂房小甲蟲PCR試劑盒通常包括引物、酶、DNA模板等反應(yīng)成分，以及PCR儀等反應(yīng)設(shè)備。使用時，將待測樣本加入試劑盒中，按照說明書上的操作步驟進行PCR反應(yīng)，最終得到檢測結(jié)果。
蜂房小甲蟲（Aethina tumida）是蜂群的寄生蟲。它的成蟲和幼蟲以蜂子、蜂蜜和蜂花粉為食,導(dǎo)致幼蜂死亡、蜂蜜發(fā)酵及巢脾被破壞。小甲蟲加速破壞蜂巢,使成年蜜蜂逃逸。其損害程度可能取決于氣候條件等因素,相比溫度和濕度較低的地區(qū),蜂房小甲蟲在較高的溫度和高濕度下的危害一般更大。蜂蜜提純設(shè)備也是蜂房小甲蟲潛在的繁殖場所,一旦蜂房小甲蟲出現(xiàn)在這種設(shè)備中,這種危害會更嚴(yán)重。從卵發(fā)育到成蟲,蜂房小甲蟲需要3~12周,周期長短取決于濕度、溫度和食物供應(yīng)。成蟲飛行時所到之處,所有規(guī)模的蜂群都會被侵?jǐn)_，因此蜂房小甲蟲的快速檢測具有重要的意義。
1、準(zhǔn)備樣品：將待測樣本進行預(yù)處理，如DNA提取、純化等步驟，以便后續(xù)的PCR反應(yīng)。
2、設(shè)計引物：根據(jù)蜂房小甲蟲的特異性基因序列，設(shè)計一對引物，用于PCR反應(yīng)的擴增。
3、配置反應(yīng)液：將PCR反應(yīng)液進行配置，包括DNA模板、引物、dNTPs等反應(yīng)成分。
4、設(shè)定PCR儀程序：根據(jù)試劑盒說明書上的設(shè)定程序，將PCR儀進行設(shè)定，如循環(huán)次數(shù)、反應(yīng)溫度等。
5、進行PCR反應(yīng)：將配置好的反應(yīng)液加入PCR儀中，按照設(shè)定的程序進行PCR反應(yīng)。
6、分析結(jié)果：在PCR反應(yīng)結(jié)束后，對結(jié)果進行分析，如出現(xiàn)特異性的擴增產(chǎn)物，則可判斷樣本中存在蜂房小甲蟲的DNA。
三、應(yīng)用
蜂房小甲蟲PCR試劑盒可以用于中華豆芫菁基因組測序分析及EchiCYP72與斑蝥素合成的相關(guān)性驗證：
開展了中華豆芫菁的全基因組測序,通過比較基因組學(xué)分析,獲得了芫菁科特有并在中華豆芫菁中顯著擴張的基因家族;從全基因組水平分析了可能與斑蝥素合成及轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因家族,進一步篩選了芫菁科特有的細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450,CYP450),并對1個芫菁科特有的CYP450(EchiCYP72)進行了與斑蝥素合成相關(guān)性的驗證。
主要研究結(jié)果如下：
(1)中華豆芫菁全基因組測序與比較基因組分析通過PacBio三代測序平臺對中華豆芫菁進行高通量測序,得到151.88 Mb的基因組數(shù)據(jù)并繪制了基因組草圖(GC含量為33.08%,contig數(shù)量為870條,N50長度為659.43 Kb,最長的scaffold為5.89 Mb),注釋得到12,520個高質(zhì)量編碼蛋白基因。使用BUSCO軟件對中華豆芫菁基因組完整性評估,結(jié)果顯示基因組完整度、重復(fù)率、缺失率分別為98.7%、2.9%、0.9%。比較基因組分析和富集分析的結(jié)果顯示發(fā)現(xiàn)氣味受體(Odorant receptor)、CYP450等45個基因家族發(fā)生了顯著的擴張。通過對以往研究的分析,發(fā)現(xiàn)CYP450家族與斑蝥素的生物合成有很大的相關(guān)性。
(2)芫菁科特有CYP450和蜂房小甲蟲PCR試劑盒的鑒定與分析鑒定了赤擬谷盜(Tribolium castaneum)蜂房小甲蟲(Aethina tumida)、光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)、米象(Sitophilus oryzae)、中歐山松大小蠹(Dendroctonus ponderosae)、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata)、白蠟窄吉丁蟲(Agrilus planipennis)等7種不產(chǎn)生斑蝥素的甲蟲和眼斑溝芫菁(Hycleus cichorii)、大斑溝芫菁(Hycleus phaleretus)、中華豆芫菁等3種芫菁科昆蟲的CYP450,共得到899個CYP450(其中包含116個中華豆芫菁的CYP450)。通過本地雙向Blast得到25個芫菁科特有的CYP450,分別屬于CYP4亞族和CYP3亞族的CYP6和CYP9。發(fā)現(xiàn)芫菁科昆蟲特有的CYP450中僅有EchiCYP72基因?qū)貱YP9,且前人未曾驗證過CYP9與斑蝥素合成的相關(guān)性。
(3)EchiCYP72基因與斑蝥素合成相關(guān)性的驗證為了驗證EchiCYP72基因與斑蝥素合成的相關(guān)性,利用蜂房小甲蟲PCR試劑盒RT-q PCR技術(shù)確定該基因在中華豆芫菁雄蟲不同時期和不同組織的表達量,并通過RNAi技術(shù)結(jié)合RT-q PCR和氣相色譜儀檢測了干擾該基因后對斑蝥素合成的影響。結(jié)果顯示注射該基因的ds RNA后顯著抑制了EchiCYP72基因的表達,干擾效率可達74.05%以上,最高為94.04%,且1d、3d、5d、7d后的斑蝥素含量分別被抑制了49.12%、31.67%、40.59%、60.59%,說明該基因與斑蝥素的合成存在較強的相關(guān)性。
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