皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和計(jì)數(shù)，你真的會嗎？
小楊 / 2024-02-19 09:05:42
成纖維細(xì)胞（fibroblast）是疏松結(jié)締組織的主要組成成分，它是由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來的。
成纖維細(xì)胞能夠分泌少量的細(xì)胞生長因子，也能合成和分泌膠原蛋白和彈性蛋白，生成諸如膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維等細(xì)胞外基質(zhì)成分。
成纖維細(xì)胞容易培養(yǎng)，取材也非常便利，容易受基因修飾，所以它常常有不同的應(yīng)用：
1）作為基因修飾的受體細(xì)胞應(yīng)用于細(xì)胞核移植、基因表達(dá)等方面；
2）作為多種干細(xì)胞如胚胎干細(xì)胞（ES）和神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）等細(xì)胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，其分泌的細(xì)胞因子可維持干細(xì)胞的未分化狀態(tài)；
3）可作為研究機(jī)體內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒體外和體內(nèi)感染性的細(xì)胞模型；
4）利用成纖維細(xì)胞大量增殖的特性，可用于機(jī)體創(chuàng)傷修復(fù)包括一般創(chuàng)傷修復(fù)和骨創(chuàng)傷修復(fù)。
1、取材
采集機(jī)體皮膚，放入含有雙抗（100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素）的無菌磷酸鹽緩沖溶液（PBS），反復(fù)洗滌多次，剪除毛茬，去除血污、脂肪和結(jié)締組織，保留真皮層，用眼科剪將皮膚剪成3~4mm的碎片。
2、原代培養(yǎng)
a.胰酶消化法：將皮膚組織塊用眼科剪剪碎后，加入適量含有0.02%EDTA的0.25%的胰酶進(jìn)行消化，置于37℃水浴鍋內(nèi)，每隔10min左右吹打搖晃一次，30min后，用100目過濾網(wǎng)濾掉組織塊，將細(xì)胞懸液1000g離心5min，去除上清液，用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，再次離心重懸后，調(diào)整細(xì)胞密度至1~5×105個(gè)/mL，接種于75mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2d換液1次。細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液。
b.組織塊貼壁培養(yǎng)法：將細(xì)碎的組織塊接種于75mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，均勻鋪于瓶底，皮塊之間相距1cm，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底向上，置于37℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)2h，使皮塊略微干涸。之后，放正培養(yǎng)瓶，使瓶底向下，加入適量培養(yǎng)液，覆蓋瓶底，放入培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2d換液1次，并觀察細(xì)胞貼壁情況。
3、傳代培養(yǎng)
當(dāng)細(xì)胞長到80%~90%匯合度時(shí)，開始進(jìn)行傳代培養(yǎng)。吸出培養(yǎng)瓶里的培養(yǎng)液，用已在37℃預(yù)熱的無鈣鎂離子的PBS溶液（DPBS）里洗滌3次，去除細(xì)胞碎片和殘余血清，然后用含0.02%EDTA的0.25%的胰酶在37℃消化2min，觀察貼壁細(xì)胞變圓時(shí)，加入含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，并用移液器吹打，使細(xì)胞脫落，吸取細(xì)胞懸液，1000g離心5min，重懸離心2次后，調(diào)整細(xì)胞密度至1~5×105個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
4、細(xì)胞凍存
凍存液的配制比例為DMEM: FBS: DMSO=7:2:1。按照傳代培養(yǎng)方法對細(xì)胞進(jìn)行消化，離心，去上清液后，用凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1~2×106個(gè)/mL，取1mL細(xì)胞懸液置于1.8mL凍存管內(nèi)，密封凍存管，并標(biāo)上細(xì)胞類型和凍存時(shí)間，將凍存管在4℃冰箱放置30min后，移入-20℃冰箱內(nèi)1.5h，之后移入-80冰箱內(nèi)過夜降溫，最后將細(xì)胞置于液氮內(nèi)，-196℃長期保存。
5、細(xì)胞復(fù)蘇
將凍存管從液氮中取出，迅速投入到37℃水浴中，并反復(fù)搖動(dòng)凍存管，使之復(fù)溫，在超凈工作臺下吸出細(xì)胞懸液放入離心管理，1000g離心5min，棄上清，用培養(yǎng)液重懸后，再次離心重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37℃，5%CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。
Countstar BF在細(xì)胞培養(yǎng)過程中的應(yīng)用
在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)過程中，不管是原代培養(yǎng)還是傳代培養(yǎng)，不管是細(xì)胞凍存還是細(xì)胞復(fù)蘇，以及后續(xù)的各種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對細(xì)胞濃度和活率的檢測都是最基礎(chǔ)的工作，也是后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)的前提。Countstar Mira BF全自動(dòng)細(xì)胞分析儀是一款基于圖像法檢測，通過采集圖像中的細(xì)胞信息，進(jìn)行定量分析，可使用配套的Countstar細(xì)胞計(jì)數(shù)板及標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格血球計(jì)數(shù)板對細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析。同時(shí)兼容3.5/6/10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，及4槽或8槽腔室載玻片，對培養(yǎng)過程中的細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)測分析。
細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞的原代培養(yǎng)，細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，細(xì)胞藥理性檢測，細(xì)胞增殖活性檢測，細(xì)胞殺傷能力檢測等各類實(shí)驗(yàn)的開展，都要清楚地知道細(xì)胞的濃度和細(xì)胞的活率，以方便我們更好地進(jìn)行傳代接種、處理樣本。Countstar Mira BF利用圖像識別原理，可得到如細(xì)胞濃度、細(xì)胞活率等結(jié)果，可同時(shí)計(jì)數(shù)5個(gè)樣品，每個(gè)樣品自動(dòng)采集3-5個(gè)視野，保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
匯合度分析
細(xì)胞匯合度是通過細(xì)胞占所培養(yǎng)的生長區(qū)域內(nèi)的面積百分比來衡量，細(xì)胞匯合度常用來評估細(xì)胞的傳代時(shí)機(jī)，及時(shí)把握時(shí)間，對維持細(xì)胞表型和培養(yǎng)質(zhì)量至關(guān)重要。
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