中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞的應(yīng)用及培養(yǎng)操作！
小楊 / 2024-02-22 08:58:14
一、背景
V79是一種來自中國倉鼠肺部的成纖維細(xì)胞系，被廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究，特別是在細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、毒理學(xué)和放射生物學(xué)等領(lǐng)域。這些細(xì)胞具有貼壁生長的特性，可以在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中迅速繁殖。
由于其較高的繁殖能力和對(duì)培養(yǎng)條件的適應(yīng)性，
V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞經(jīng)常被選作實(shí)驗(yàn)室研究的模型系統(tǒng)。在細(xì)胞生物學(xué)研究中，V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞可用于研究細(xì)胞周期、細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡等基本生物學(xué)過程。在遺傳學(xué)和基因工程研究中，這些細(xì)胞可用于基因轉(zhuǎn)染、基因敲除和基因表達(dá)調(diào)控等實(shí)驗(yàn)。在毒理學(xué)研究中，V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞可用于評(píng)估化學(xué)物質(zhì)、藥物、輻射等外界因素對(duì)細(xì)胞的毒性作用。在放射生物學(xué)研究中，V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性使其成為研究輻射損傷和修復(fù)機(jī)制的理想模型。
此外，
V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞還可用于藥物篩選和細(xì)胞治療等應(yīng)用研究。例如，在藥物篩選中，V79細(xì)胞可用于測試新藥物的細(xì)胞毒性、抗增殖作用或細(xì)胞保護(hù)作用。在細(xì)胞治療中，盡管V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞本身不是用于治療目的的細(xì)胞類型，但它們可以作為細(xì)胞培養(yǎng)的飼料層或共培養(yǎng)系統(tǒng)來支持其他細(xì)胞類型的生長和分化。
1)復(fù)蘇V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
選取PM2.5中礦物主要成分方解石、鈉長石、石英、絹云母等粉塵，將四種礦物粉塵分別作用于中國倉鼠肺細(xì)胞（Chinese Hamster LungCell，V79細(xì)胞），研究其對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，探討其產(chǎn)生毒性作用的相關(guān)機(jī)制。
方法：
（1）采用X射線熒光光譜分析法測定原礦物樣品化學(xué)組成，經(jīng)激光粒度分析儀分析四種礦物粉塵粒徑分布。
（2）實(shí)驗(yàn)組選取處于對(duì)數(shù)生長期的V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后分別加入50、100、200、400μg/ml的四種礦物粉塵懸液，設(shè)置陰性對(duì)照組加入相同劑量的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h后。用噻唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，比較各組細(xì)胞的存活率。
（3）瑞氏-吉姆薩(Wright-Giemsa)染色，油鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)改變，計(jì)數(shù)微核細(xì)胞千分率。
（4）彗星實(shí)驗(yàn)（SCGE）檢測各組細(xì)胞DNA的損傷程度。每種濃度隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞彗星圖像，CASP彗星分析軟件分析彗星圖像，以尾矩(OTM)作為分析指標(biāo)。
（5）直線相關(guān)分析方法分析V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞存活率同微核率、尾矩（OTM）值相關(guān)性。
（6）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測各組細(xì)胞上清液中白細(xì)胞介素-6（IL-6）含量，分析礦物粉塵產(chǎn)生毒性作用的相關(guān)機(jī)制。
結(jié)果：
（1）實(shí)驗(yàn)所選用礦物粉塵石英、絹云母、鈉長石的化學(xué)組成成分中所含二氧化硅（SiO2）含量最高，而礦物粉塵方解石所含氧化鈣（CaO）含量最高；四種礦物粉塵經(jīng)檢測其平均粒徑均<2.5um，符合實(shí)驗(yàn)要求。
（2）同對(duì)照組相比較，四種礦物粉塵均能影響V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞存活率，隨礦物濃度的增高，細(xì)胞存活率降低，細(xì)胞存活率與礦物粉塵的濃度呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；與礦物鈉長石、方解石相比較，礦物石英、絹云母導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降更加明顯。
（3）隨著四種礦物粉塵濃度的增加，細(xì)胞微核率均有增加，其微核率從大到小順序?yàn)椋航佋颇福臼ⅲ锯c長石＞方解石。各粉塵組在400ug/ml的高濃度時(shí)，其微核率同陰性對(duì)照組比較，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），鈉長石、石英和絹云母三種礦物在此濃度的細(xì)胞微核率與陰性對(duì)照組更是有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
（4）四種礦物粉塵對(duì)V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞的DNA損傷呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，礦物粉塵濃度越高，DNA損傷越明顯。鈉長石、石英和絹云母高濃度暴露組的細(xì)胞OTM值與陰性對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
（5）暴露在不同礦物粉塵中的細(xì)胞存活率的變化同細(xì)胞微核率的變化均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，細(xì)胞存活率的變化同細(xì)胞OTM值的變化同樣均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
（6）四種礦物粉塵均能使V79（中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞）細(xì)胞培養(yǎng)液上清液中的IL-6含量升高，其中石英和絹云母暴露組濃度升至100μg/ml及以上，其IL-6含量與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
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