NCI-H1944人非小細(xì)胞肺癌貼壁細(xì)胞系的應(yīng)用研究！
小楊 / 2024-03-14 08:56:34
一、背景
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）細(xì)胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細(xì)胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺中，化凍的細(xì)胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細(xì)胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細(xì)胞貼壁情況（未貼壁的即為死細(xì)胞--針對貼壁細(xì)胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
1）待細(xì)胞生長到80%-90%匯合度時，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細(xì)胞消化時間不同），取出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞至細(xì)胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細(xì)胞脫落下來成單個細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細(xì)胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
1）按照細(xì)胞傳代方法，在超凈工作臺內(nèi)消化收集細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
三、應(yīng)用
在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中,哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)(m TOR)異常激活促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PQR620是一種新型高效的m TOR激酶抑制劑。
在這里測試了它在NSCLC細(xì)胞中的潛在活性。在原代人類NSCLC細(xì)胞和已建立的細(xì)胞系(A549和NCI-H1944)中,PQR620抑制細(xì)胞生長、增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,以及細(xì)胞遷移和侵襲,同時顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PQR620破壞了m TOR復(fù)合物1(m TOR-Raptor)和m TOR復(fù)合物2(m TOR-Rictor-Sin1)的組裝,并阻斷了NSCLC細(xì)胞中的Akt、S6K1和S6磷酸化。過表達(dá)持續(xù)性激活的Akt1(S473D)激活A(yù)kt-m TOR信號通路僅部分抑制PQR620誘導(dǎo)的NSCLC細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
PQR620在Akt1/2沉默的NSCLC細(xì)胞中仍然具有細(xì)胞毒性,這表明PQR620并不完全依賴Akt-m TOR信號發(fā)揮抑制NSCLC進(jìn)展的功能。
事實上,PQR620在原發(fā)性NSCLC細(xì)胞中誘導(dǎo)鞘氨醇激酶1(Sph K1)抑制、神經(jīng)酰胺產(chǎn)生和氧化應(yīng)激。體內(nèi)研究表明,每天口服單劑PQR620可有效抑制嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠的原發(fā)性NSCLC異種移植物生長。在PQR620處理的裸鼠移植瘤中,檢測到Akt-m TOR失活、凋亡誘導(dǎo)、Sph K1抑制和氧化應(yīng)激。
總之,PQR620通過m TOR依賴性和非依賴性機(jī)制發(fā)揮有效的抗NSCLC細(xì)胞活性。
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