廣西高溫放線菌的培養(yǎng)方法與實驗內(nèi)容及注意事項！
小楊 / 2024-05-30 09:46:52
廣西高溫放線菌是Thermoactinomyces屬的微生物，原產(chǎn)地為中國。主要用途為分類；研究。
一、菌種簡介
規(guī)格：凍干粉
拉丁屬名：Thermoactinomyces Guangxiensis
拉丁名稱：Thermoactinomyces guangxiensis
來源歷史：←CGMCC
收藏時間：2016/12/27
原始編號：CD-1
原產(chǎn)國：中國
資源歸類編碼：15131500000
模式菌株：模式菌株
主要用途：分類；研究
特征特性：好氧，呈絲狀，不產(chǎn)色素，氣生菌絲呈白色，基內(nèi)菌絲呈淺黃色，孢子梗上著生單個內(nèi)生孢子，孢子表面光滑，最適生長溫度45℃-50℃，最適pH 7.0-9.0，可以水解次黃嘌呤、酪蛋白和淀粉，不能水解L-酪氨酸、腺嘌呤、鳥嘌呤、七葉苷、木聚糖和黃嘌呤。過氧化氫酶、明膠液化和牛奶胨化實驗陽性。H2S產(chǎn)生、氧化酶、黑色素產(chǎn)生和硝酸鹽還原實驗陰性。可以水解吐溫20、40、60和80，可以使用蔗糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、棉籽糖、D-山梨醇、麥芽糖、乙酸鈉、丙酸鈉和檸檬酸鈉作為單一碳源，可以利用脯氨酸、L-酪氨酸、次黃嘌呤、D-蘇氨酸、D-組氨酸、L-絲氨酸和蛋氨酸作為唯一氮源。胞壁氨基酸為meso-DAP，全細(xì)胞糖為核糖和葡萄糖，極性脂為雙磷脂酰甘油（DPG）、磷脂酰甘油（PG）主要醌型為MK-7， 主要脂肪酸為 iso-C15:0、C16:0、 anteiso-C15:0、 iso-C17:0 和iso-C16:0。 DNA G+C 含量為 48.8 mol%。GenBank基因序列接收號：KJ027602。
生物危害程度：四類
培養(yǎng)基編號：CM0847
培養(yǎng)基名稱：胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）(CAIQ0701)
培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨 15.0g，大豆胨 5.0g，氯化鈉 5.0g，瓊脂 13.0 g，蒸餾水 1.0L，pH7.3±0.2。
培養(yǎng)溫度：45℃
需氧類型：好氧
分離基物：蘑菇堆肥
采集地：廣西壯族自治區(qū)
保存方法：液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法
共享方式：公益性共享；資源純交易性共享；合作研究共享；資源交換性共享
提供形式：凍干物
用途：分類；研究
注意事項：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
二、形態(tài)特征
廣西高溫放線菌，好氧，呈絲狀，不產(chǎn)色素，氣生菌絲呈白色，基內(nèi)菌絲呈淺黃色，孢子梗上著生單個內(nèi)生孢子，孢子表面光滑，最適生長溫度45℃-50℃，最適pH 7.0-9.0，可以水解次黃嘌呤、酪蛋白和淀粉，不能水解L-酪氨酸、腺嘌呤、鳥嘌呤、七葉苷、木聚糖和黃嘌呤。過氧化氫酶、明膠液化和牛奶胨化實驗陽性。H2S產(chǎn)生、氧化酶、黑色素產(chǎn)生和硝酸鹽還原實驗陰性?？梢运馔聹?0、40、60和80，可以使用蔗糖、D-果糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-鼠李糖、棉籽糖、D-山梨醇、麥芽糖、乙酸鈉、丙酸鈉和檸檬酸鈉作為單一碳源，可以利用脯氨酸、L-酪氨酸、次黃嘌呤、D-蘇氨酸、D-組氨酸、L-絲氨酸和蛋氨酸作為唯一氮源。胞壁氨基酸為meso-DAP，全細(xì)胞糖為核糖和葡萄糖，極性脂為雙磷脂酰甘油（DPG）、磷脂酰甘油（PG）主要醌型為MK-7，主要脂肪酸為 iso-C15:0、C16:0、anteiso-C15:0、 iso-C17:0 和iso-C16:0。DNA G+C 含量為 48.8 mol%。GenBank基因序列接收號：KJ027602。
三、培養(yǎng)方法
1、菌種是指食用菌菌絲體及其生長基質(zhì)組成的繁殖材料。菌種分為母種（一級種）、原種（二級種）和栽培種（三級種）三級。工業(yè)發(fā)酵的有用菌種，其篩選步驟包括菌種分離、初篩和復(fù)篩。
2、挑選具有某種能力的有用菌種，也稱種子制備，是指菌種在一定條件下，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)成為具有一定數(shù)量和質(zhì)量的純生產(chǎn)菌種的制備過程。以作接入發(fā)酵罐中進(jìn)一步擴(kuò)大菌體量及合成產(chǎn)物之用。
3、種子制備包括孢子制備和菌絲體制備菌種制備。
4、保存在沙土管或冷凍管中的生產(chǎn)菌種，用無菌手續(xù)挑取少許，接入瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在25℃（或較高溫度）下培養(yǎng)5～7天（或較長時間。所得孢子還需進(jìn)一步用較大表面積的固體培養(yǎng)基以獲得更多孢子（對于霉菌類孢子制備，多數(shù)采用大米、小米之類的天然培養(yǎng)基）。
5、將培養(yǎng)成熟的斜面孢子制成懸浮液，接種到扁瓶固體培養(yǎng)基上，于25～28℃培養(yǎng)14天。將成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中備用。一次制得的孢子瓶可在生產(chǎn)上延續(xù)使用半年左右。
6、如果有些生產(chǎn)菌種不產(chǎn)孢子，如赤霉素產(chǎn)生菌或產(chǎn)孢子不多的，則可采用搖瓶液體培養(yǎng)制得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發(fā)芽、生長、繁殖成大量菌體。其中的培養(yǎng)基組分應(yīng)是易于被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿），及無機(jī)鹽(如磷酸鹽)等。作為發(fā)酵罐的種子應(yīng)生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯，無雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。
四、實驗內(nèi)容
1、稱量→溶化→調(diào)ph→過濾→分裝→加塞→包扎→滅菌→無菌檢查
2、干熱滅菌：裝入待滅菌物品→升溫→恒溫→降溫→開箱取物
3、高壓蒸汽滅菌：加水→裝物品→加蓋→加熱→排冷空氣→加壓→恒壓→降壓回零→排汽→取物→無菌檢查
4、過濾除菌：組裝滅菌→連接→壓濾→無菌檢查→清洗滅菌
五、保藏方法
1、傳代培養(yǎng)保藏法
又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等(后者作保藏厭氧細(xì)菌用),培養(yǎng)后于4-6℃冰箱內(nèi)保存。
2、液體石蠟覆蓋保藏法
是傳代培養(yǎng)的變相方法,能夠適當(dāng)延長保藏時間,它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟,一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡,另一方面可阻止氧氣進(jìn)入,以減弱代謝作用。
3、載體保藏法
是將微生物吸附在適當(dāng)?shù)妮d體,如土壤、沙子、硅膠、濾紙上,而后進(jìn)行干燥的保藏法,例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當(dāng)廣泛。
4、寄主保藏法
用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物,如病毒、立克次氏體、螺旋體等,它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代,此法相當(dāng)于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進(jìn)行保藏。
5、冷凍保藏法
可分低溫冰箱(-20-30℃,-50-80℃)、干冰酒精快速凍結(jié)(約-70℃)和液氮(-196℃)等保藏法。
6、冷凍干燥保藏法
先使微生物在極低溫度(-70℃左右)下快速冷凍,然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分(真空干燥)。有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護(hù)劑來制備細(xì)胞懸液,以防止因冷凍或水分不斷升華對細(xì)胞的損害。保護(hù)性溶質(zhì)可通過氫和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。保護(hù)劑有牛乳、血清、糖類、甘油、二甲亞砜等。
六、注意事項
1、菌種常規(guī)培養(yǎng)時間：細(xì)菌 1-2 天，酵母 3 天，霉菌 5-7 天，大型真菌 7-10 天。
2、菌種恢復(fù)培養(yǎng)前，建議將收到的菌種安瓿保存在 6-10°C 的環(huán)境下，某些菌種經(jīng)過冷凍干燥保存后處于休眠狀態(tài)，延遲期較長，如在說明建議的培養(yǎng)時間還未長起來，請繼續(xù)在相應(yīng)的環(huán)境下多培養(yǎng) 24 小時或者更長時間，直至菌種培養(yǎng)完成，有的菌種需要連續(xù)兩次繼代培養(yǎng)才能正常生長，一般來說菌種培養(yǎng)穩(wěn)定后才能用于您的后續(xù)實驗。
3、初次使用時請嚴(yán)格按照本說明書推薦條件和操作步驟進(jìn)行復(fù)活培養(yǎng)，如使用其它類型培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件造成菌種不活等損失，我單位不負(fù)責(zé)任。
4、恢復(fù)培養(yǎng)厭氧菌時，在操作過程中應(yīng)嚴(yán)格控制厭氧條件：制作培養(yǎng)基時，應(yīng)使用厭氧螺口試管，并利用高純氮氣去除試管和培養(yǎng)基中的氧氣，使用者應(yīng)保證菌種的安全存儲和操作，帶菌廢棄物應(yīng)高壓滅菌處理后丟棄。
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