人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的復(fù)蘇與傳代及凍存操作說明！
小楊 / 2024-05-31 09:44:46
細(xì)胞簡介
規(guī)格：1×10?Cells/T25培養(yǎng)瓶
細(xì)胞信息：HKF
產(chǎn)品規(guī)格：T25培養(yǎng)瓶x1；1.5ml凍存管x2
細(xì)胞數(shù)量：1x10^6；1x10^6
保存溫度：37℃；-198℃
運(yùn)輸方式：常溫保溫運(yùn)輸；干冰運(yùn)輸
安全等級：1
用途限制：僅供科研3類
培養(yǎng)體系：DMEM高糖培養(yǎng)基（不含丙酮酸鈉）+10%FBS+1%三抗
培養(yǎng)溫度：37℃
二氧化碳濃度：5%
注釋：倍增時間39h
用途：細(xì)胞系
注意事項：僅用于科學(xué)研究或者工業(yè)應(yīng)用等非醫(yī)療目的不可用于人類或動物的臨床診斷或治療，非藥用，非食用（產(chǎn)品信息以出庫為準(zhǔn)）
細(xì)胞復(fù)蘇操作說明（針對凍存細(xì)胞）
實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺 ，CO2 培養(yǎng)箱 ，倒置顯微鏡 ，水浴鍋 ，離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM 培養(yǎng)基 ，胎牛血清 ，三抗
實(shí)驗(yàn)材料：T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶 ，需復(fù)蘇的細(xì)胞 ，移液槍 ，槍頭 ，離心管
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、從液氮罐中取出凍存管 ，直接浸入 37℃溫水中 ，并不時搖動令其盡快融化。
2、從 37℃水浴中取出凍存管 ，打開蓋子，移液槍吸出細(xì)胞懸液 ，加到離心管并滴加 5 倍以上完全培養(yǎng)基并混勻。
3、操作離心，調(diào)至 1000 轉(zhuǎn)/分 ，時長 10 分鐘
4、棄去上清液，重懸離心管底部細(xì)胞沉淀，在 T25 培養(yǎng)瓶中加入 5-6ml 完全培養(yǎng)基，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5、次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。
6、注意：凍存細(xì)胞建議三管一起復(fù)蘇到一個 T25 培養(yǎng)瓶中。
細(xì)胞傳代操作說明（貼壁細(xì)胞）
實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺 ，CO2 培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰酶 ，三抗
實(shí)驗(yàn)材料：T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，需傳代的細(xì)胞，移液槍，槍頭 ，離心管
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、細(xì)胞于培養(yǎng)箱中，愈合度達(dá)到 80% ，可進(jìn)行傳代。
2、按 T25 培養(yǎng)瓶計，吸出完全培養(yǎng)基，并 PBS 緩沖液輕沖 3 遍，添加 0.25%含 EDTA 胰酶 2ml ，消化 2min（具體時間視細(xì)胞而定），后用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來。1000r/min 離心 10 min ，棄上清收集細(xì)胞，鋪至 2 個 T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，各添加 7ml 完全培養(yǎng)基。
3、注意：消化時間不易過長，消化前血清成分務(wù)必去除干凈，終止消化請用新鮮完全培養(yǎng)基，原瓶培養(yǎng)基不可繼續(xù)使用（終止消化或傳代）。
細(xì)胞傳代操作說明（懸浮細(xì)胞）
實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺 ，CO2 培養(yǎng)箱 ，倒置顯微鏡，離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM 培養(yǎng)基 ，胎牛血清 ，三抗
實(shí)驗(yàn)材料：T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，需傳代的細(xì)胞 ，移液槍，槍頭 ，離心管
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、細(xì)胞于培養(yǎng)箱中，密度達(dá)到懸浮細(xì)胞傳代標(biāo)準(zhǔn)（沉降后可鋪滿底面），可進(jìn)行傳代。
2、按 T25 培養(yǎng)瓶計，吹打均勻，吸出完全培養(yǎng)基，1000r/min 離心 10 min，棄上清收集細(xì)胞，鋪至 2 個T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，各添加 7ml 完全培養(yǎng)基。
3、注意：原瓶培養(yǎng)基不可繼續(xù)使用（傳代）。
細(xì)胞凍存操作說明
實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺，CO2 培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，離心機(jī)
實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM 培養(yǎng)基，胎牛血清，0.25%胰酶 ，三抗 ，DMSO
實(shí)驗(yàn)材料：T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，需凍存的細(xì)胞，移液槍，槍頭 ，離心管，凍存管，記號筆
實(shí)驗(yàn)步驟：
1、取待凍存的細(xì)胞（按 T25 計 ）用 0.25EDTA 胰酶 2ml 消化 2min ，用完全培養(yǎng)基將細(xì)胞沖洗下來。1000r/min 離心 10min ，棄上清收集細(xì)胞。如果是懸浮生長的細(xì)胞，則可直接離心收集細(xì)胞。
2、加入 1ml 凍存液(90%FBS+10%DMSO )制成細(xì)胞懸液。
3、細(xì)胞懸液裝入 3 支凍存管中。
4、凍存管在 4℃下存放 30 min ，轉(zhuǎn)放-20℃ 1.5～2 h ，再轉(zhuǎn)人-70℃ 4-12 h 后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)(- 196℃) ，并登記。
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