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百歐博偉生物：菌種在傳代過(guò)程中，因遺傳物質(zhì)發(fā)生變異而引起的原有的優(yōu)良性狀漸漸消失或變壞，出現(xiàn)長(zhǎng)勢(shì)差、發(fā)酵效價(jià)不高、質(zhì)量不好、菌落叢生等現(xiàn)象。這些現(xiàn)象人們泛稱為“退化”。 菌種退化是一個(gè)漸變的過(guò)程，發(fā)生有害變異的個(gè)體在群體中顯著增多以至占據(jù)優(yōu)勢(shì)時(shí)才會(huì)顯露出來(lái)。因此盡管個(gè)體的變異可能是一個(gè)瞬時(shí)的過(guò)程，但菌種呈現(xiàn)“退化”卻需要較長(zhǎng)的時(shí)間。菌種退化的本質(zhì)是染色體的變異，自然界中生物體發(fā)生變異是絕對(duì)的，如果這種變異朝著人們認(rèn)為是壞的方向發(fā)展，就會(huì)造成退化。菌種的整體性能，在不因外界因素而逐漸變差，且會(huì)遺傳給下一代，就稱為菌株退化。

 

需要注意的是，退化和老化是兩個(gè)截然不同的概念。菌種培育過(guò)程中隨著菌齡的增加，養(yǎng)分不斷消耗，菌種必然會(huì)出現(xiàn)老化現(xiàn)象。菌體老化后，其生命力衰退，色素分泌增加，細(xì)胞中空泡增多，甚至破裂。老化的菌種接入培養(yǎng)基后表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)慢、抵抗雜菌能力弱、產(chǎn)酶能力下降等。老化現(xiàn)象不會(huì)傳給子代，這是與退化的最大區(qū)別。所以，一旦菌株出現(xiàn)了異?，F(xiàn)象，首先要分清是老化還是退化，或是單純因?yàn)橥饨缗囵B(yǎng)條件發(fā)生變化而引起。如果是因老化或外界條件變化引起的異常, 采用新的培養(yǎng)基及適合的培養(yǎng)條件后菌株生長(zhǎng)會(huì)恢復(fù)原狀；如果是因退化而引起，則不會(huì)改變生長(zhǎng)的惡劣狀況，這時(shí)就要對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)壯。本文將對(duì)菌種退化的原因加以簡(jiǎn)析，并給出相應(yīng)有效的預(yù)防措施及復(fù)壯技術(shù)。

 

 

 

根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)觀點(diǎn)，細(xì)胞變異和分裂速度密切相關(guān)，分裂速度越快，變異將會(huì)越多。微生物由于分裂速度很快，分裂中的變異數(shù)量將會(huì)增加，而菌種退化與細(xì)胞變異密切相關(guān)。據(jù)有關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，通常每三百個(gè)細(xì)胞中，就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)變異。在多代傳代繁殖中，變異概率將會(huì)更高。當(dāng)菌種遺傳物質(zhì)發(fā)生變異之后，突變體往往更能適應(yīng)外界環(huán)境條件，變異的細(xì)胞再分裂，變異體將會(huì)越來(lái)越多，直到最后代謝能力完全退化。

 

 

菌種制備時(shí)，菌體培養(yǎng)在特定的培養(yǎng)基上，這些培養(yǎng)基通常具備菌種生長(zhǎng)、發(fā)育及繁殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、糖類、生長(zhǎng)因子及水等。但是，由于各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的配比不一定最優(yōu)，即使一個(gè)優(yōu)良的菌株，如果長(zhǎng)期使用基本相同的培養(yǎng)基，其營(yíng)養(yǎng)不能達(dá)到生理要求，長(zhǎng)此以往培育下去，必然造成營(yíng)養(yǎng)不良。除了培養(yǎng)成分配比之外，培養(yǎng)環(huán)境也是重要方面，如果對(duì)其控制不當(dāng)，將會(huì)嚴(yán)重影響菌種的生長(zhǎng)繁殖。比如微生物培養(yǎng)時(shí)，通常會(huì)分泌多種胞外酶，如纖維素酶、果膠酶及半纖維素酶等，以分解有機(jī)物進(jìn)而獲得營(yíng)養(yǎng)及能量，當(dāng)培養(yǎng)條件不適合時(shí)，這些酶類分泌量會(huì)大幅度減少，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)無(wú)法利用，從而生長(zhǎng)停止，如果這種情況長(zhǎng)期發(fā)展下去，將會(huì)導(dǎo)致菌種退化。

 

 

目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)防止菌種退化的最好辦法是采用液態(tài)氮超低溫保藏。此外，菌種長(zhǎng)期保存或長(zhǎng)期使用后，菌絲長(zhǎng)勢(shì)減弱，容易提前出現(xiàn)老化現(xiàn)象。一般的保藏方法，菌株雖在低溫下保藏，但并未完全停止其生命活動(dòng)，仍然存在著變異的可能。

 

 

在菌種繼代培養(yǎng)過(guò)程中，不同品種間交叉感染，導(dǎo)致不同品種的菌絲體混雜在一起，造成原有品種生產(chǎn)性狀的改變，常常表現(xiàn)出產(chǎn)量下降、質(zhì)量變劣等退化現(xiàn)象。

 

 

對(duì)于基因工程菌來(lái)說(shuō)，菌種退化是一個(gè)無(wú)法回避的問(wèn)題，也是影響正常發(fā)酵生產(chǎn)的最大障礙。其具體表現(xiàn)形式一般為發(fā)酵早期溶菌、菌體生長(zhǎng)緩慢、糖代謝異常、發(fā)酵OD低以及酶活（效價(jià)）差等，嚴(yán)重影響了發(fā)酵批次的穩(wěn)定性。對(duì)于工程大腸桿菌來(lái)說(shuō)，其異常表現(xiàn)與污染噬菌體有類似之處，判斷起來(lái)有一定的迷惑性。而究其原因，大多數(shù)情況是由于宿主感受態(tài)自身發(fā)生老化或退化引起。這種情況下，即使更換發(fā)酵設(shè)備或者對(duì)發(fā)酵環(huán)境全面凈化處理也無(wú)濟(jì)于事。

 

 

 

在菌種培養(yǎng)中，為了保證菌種質(zhì)量，每隔1至2年，必須對(duì)原菌種進(jìn)行分離。菌種純化是常用的一種復(fù)壯方法。原理是定期分離菌種，將退化的菌種分離剔除，挑選出具有優(yōu)良性狀的菌株在適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，恢復(fù)菌種原有的生長(zhǎng)狀態(tài)，再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

 

 

由于菌種退化和傳代次數(shù)密切相關(guān)，應(yīng)在培養(yǎng)中給予重視，一般情況下，代數(shù)不能超過(guò)5代。菌種在多次傳代過(guò)程中會(huì)發(fā)生少量基因的突變，到突變達(dá)到一定程度時(shí)，就會(huì)造成遺傳物質(zhì)的改變，然而頻繁傳代一般都是負(fù)變異占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。因此，控制菌種的傳代次數(shù)也是防止菌種退化和維持原有性狀的有效措施之一。

 

 

建議采用液氮超低溫保藏，液氮超低溫保藏法是將需要保藏的菌種和保護(hù)劑按一定的比例放于凍存管中，再將凍存管保藏在超低溫液氮中。常用的保護(hù)劑有甘油、血清蛋白、二甲基亞礬、聚乙烯氮戊環(huán)、糊精、吐溫80等，不同的菌種要根據(jù)自己的特性選擇不同的保護(hù)劑。在超低溫環(huán)境中菌種幾乎喪失了代謝功能，保持了菌株原有的性狀，變異的可能性也大大降低，這種方法對(duì)大部分菌株都適用，且保存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)數(shù)年。具體操作方法：把已做好的安瓿菌種管放入具有孔洞的小塑料瓶中（ 在塑料瓶的底部放一塊重物，使塑料瓶連同安瓿管能一起沉入液氮罐中），蓋好瓶蓋，在瓶蓋上連接一條細(xì)繩并作記號(hào)，以便提出所需的菌種。把裝有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管緩慢地降溫，大約30分鐘后，把安瓿管浸入液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。啟用液氮罐中保存的菌種時(shí)， 應(yīng)先將安瓿管置于35~40℃的溫水中，使瓶?jī)?nèi)的冰塊迅速融解，然后在無(wú)菌條件下開(kāi)啟安瓿管，用接種針取菌塊移接于適宜的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。

 

 

挑取健壯菌絲體頂端部分進(jìn)行純化培養(yǎng)，以保持菌種的純度，使菌種恢復(fù)原來(lái)的生活力和優(yōu)良種性，達(dá)到復(fù)壯的目的。

 

 

長(zhǎng)期在同一培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)的菌種，活力可能逐漸下降。在菌種保藏傳代中，經(jīng)常改變培養(yǎng)基成分，或在原有的培養(yǎng)基中添加酵母膏、麥芽汁、氨基酸類物質(zhì)和維生素等，以刺激菌絲生長(zhǎng)，提高菌種活力。

 

 

工程菌出現(xiàn)菌種退化問(wèn)題后，技術(shù)人員常用的對(duì)策是重新轉(zhuǎn)化保種，誤以為這樣可以解決問(wèn)題，這種做法對(duì)有些退化情況或者短期內(nèi)可能有一定效果，但其實(shí)并不能徹底解決問(wèn)題，類似發(fā)酵異常問(wèn)題往往還是周而復(fù)始反復(fù)出現(xiàn)。需要明白的是，宿主本身也是菌種，也存在老化退化問(wèn)題，只有更換原始出發(fā)宿主菌，并更新其相應(yīng)感受態(tài)，然后再轉(zhuǎn)化保種，才有可能根治頑疾。

 

 

1、菌種活化：將酵母菌種接種在5 % YPD 固體斜面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，重復(fù)2 次。用滅菌牙簽挑取適量活化的酵母菌斑接種于5 mL 液體YPD 培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)12～16 h，此時(shí)可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

 

2、初篩：取上述活化菌液100 μL，置于5 mL PDA 培養(yǎng)基3 種不同的液體培養(yǎng)基中，于30℃、200 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)12～16 h，分別稀釋為10 萬(wàn)倍和100 萬(wàn)倍2 個(gè)濃度梯度，取50 μL 稀釋液涂布到相應(yīng)的固體PDA 培養(yǎng)基平皿中，30 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察并記錄菌落生長(zhǎng)情況。

 

3、復(fù)篩：挑出光滑圓潤(rùn)、色澤乳白、形狀規(guī)則且較大的菌斑，用牙簽挑取少許置于5 mL PDA液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r/min 搖培過(guò)夜。取1.5 mL 菌液3500 r/min 離心5 min 得菌體，加入1 mL PDA液體培養(yǎng)基重懸，山梨醇、甘油處理過(guò)夜。取1 mL 處理后的菌液離心得菌體，分別加入1 mLPDA液體培養(yǎng)基重懸，稀釋10 萬(wàn)倍后涂布在固體PDA培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后觀察記錄。

 

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