四號(hào)瓊脂培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)使用流程及關(guān)鍵注意事項(xiàng)與質(zhì)控！
小楊 / 2025-12-29 09:30:16
四號(hào)瓊脂是用于霍亂弧菌選擇性分離的固體培養(yǎng)基，通過高 pH 與復(fù)合抑菌體系抑制雜菌，同時(shí)提供適宜營養(yǎng)與生長(zhǎng)刺激，使霍亂弧菌形成特征菌落以便挑取純化與鑒定。
一、核心原理
營養(yǎng)支撐：蛋白胨、牛肉膏粉提供碳氮源與生長(zhǎng)因子；氯化鈉維持滲透壓；亞硫酸鈉刺激弧菌增殖。
選擇性抑制：十二烷基硫酸鈉、膽鹽、慶大霉素、亞碲酸鉀協(xié)同抑制革蘭氏陽性菌及多數(shù)革蘭氏陰性雜菌；終 pH 8.5±0.2，適配霍亂弧菌耐堿特性，同時(shí)抑制酸耐受雜菌。
凝固與顯色：瓊脂為凝固劑；亞碲酸鉀可使霍亂弧菌菌落呈現(xiàn)灰黑色或中心發(fā)黑，便于識(shí)別。
二、典型配方（每升）
成分 含量 作用
蛋白胨 20.0g 碳氮源
牛肉膏粉 5.0g 生長(zhǎng)因子
氯化鈉 5.0g 滲透壓
無水亞硫酸鈉 3.0g 刺激弧菌
十二烷基硫酸鈉 0.5g 抑菌
豬膽汁粉 5.0g 抑菌
雷佛奴爾 0.03g 抑菌
慶大霉素 500U 抑菌
瓊脂 15.0g 凝固劑
三、標(biāo)準(zhǔn)使用流程（干粉制備，1L）
稱量與溶解：稱取干粉 53.5g，加蒸餾水/去離子水 1L，加熱煮沸至完全溶解，攪拌均勻；無需高壓滅菌（避免破壞抑菌成分）。
降溫與加添加劑：冷卻至 50℃左右，無菌操作加入亞碲酸鉀溶液（如 1% 亞碲酸鉀 1mL/L 或按試劑盒說明），迅速混勻。
傾注與凝固：立即傾注無菌平皿，靜置凝固后倒置存放備用；成品平板拆包即用。
接種與培養(yǎng)：無菌接種樣品（劃線或涂布），35～37℃培養(yǎng) 24～48h，觀察菌落形態(tài)與顏色。
挑取與鑒定：挑取灰黑色/中心發(fā)黑、光滑濕潤(rùn)的可疑菌落，轉(zhuǎn)種 TCBS 或營養(yǎng)瓊脂純化，再做生化與血清學(xué)鑒定。
四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與質(zhì)控
無菌操作：全程無菌，防止污染；添加劑在 50℃左右加入，避免高溫失活或低溫凝固。
溫度與 pH：溶解后冷卻至 50℃左右傾注；必要時(shí)校正 pH 至 8.5±0.2。
質(zhì)控菌株（35～37℃，48h）：霍亂弧菌（ATCC 25872 等）應(yīng)生長(zhǎng)良好，菌落灰黑/中心發(fā)黑；
大腸埃希菌、
金黃色葡萄球菌應(yīng)被顯著抑制或不生長(zhǎng)。
安全與合規(guī)：霍亂弧菌為高致病性菌，需在生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室操作，嚴(yán)格按規(guī)程消毒與處置廢棄物；遵循當(dāng)?shù)胤ㄒ?guī)與標(biāo)準(zhǔn)方法。
五、常見問題與排查
雜菌過多：接種量過大、樣品污染、添加劑未加或失效、操作污染；減少接種量、復(fù)檢添加劑效價(jià)、加強(qiáng)無菌操作。
無目標(biāo)菌落：樣品中無霍亂弧菌、培養(yǎng)基 pH 偏離、添加劑過量、培養(yǎng)溫度/時(shí)間不足；復(fù)核 pH、調(diào)整添加劑用量、延長(zhǎng)培養(yǎng)至 48h。
菌落不顯色：亞碲酸鉀未加或失效；更換新鮮添加劑，嚴(yán)格按比例添加。
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