單增李斯特菌的溶血試驗(yàn)與協(xié)同溶血試驗(yàn)的注意事項(xiàng)！
小楊 / 2025-12-29 10:19:52
一、溶血試驗(yàn)（自身溶血）的注意事項(xiàng)
溶血試驗(yàn)是初篩步驟，主要觀察
單增李斯特菌是否產(chǎn)生溶血素 LLO，形成特定的 β 溶血圈。
1、培養(yǎng)基的選擇與制備
血液來(lái)源與質(zhì)量：必須使用新鮮的羊血。陳舊的羊血會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，影響溶血圈的觀察。血液與培養(yǎng)基的比例通常為 5-10%（v/v）。
平板狀態(tài)：使用前檢查平板是否有污染、干裂或變色。平板應(yīng)在 4℃冷藏保存不超過(guò) 3 天，且需在室溫下平衡至與環(huán)境溫度一致（約 15-25 分鐘）再進(jìn)行接種，以避免冷凝水影響菌落生長(zhǎng)和溶血圈形成。
無(wú)菌操作：制備和接種過(guò)程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)范，防止雜菌污染。
2、菌株的準(zhǔn)備
純培養(yǎng)物：使用新鮮的、純培養(yǎng)的單菌落進(jìn)行接種。陳舊培養(yǎng)物或不純的菌落可能導(dǎo)致結(jié)果不準(zhǔn)確。最好使用在胰酪大豆胨瓊脂（TSA）或腦心浸液瓊脂（BHI）上 36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)的菌株。
菌液濃度：挑取的菌量要適中，以能形成一個(gè)小的、清晰的菌落為宜。通常用接種環(huán)尖端挑取單個(gè)菌落。
3、接種方法
穿刺接種：使用接種針或接種環(huán)的尖端，從平板表面垂直刺入瓊脂約 2/3 深度，到達(dá)接近平板底部但不觸及底部的位置，然后沿原穿刺線拔出。穿刺深度要一致，以確保不同菌株的溶血圈大小具有可比性。
避免損傷：穿刺時(shí)動(dòng)作要輕柔，避免在瓊脂中劃出多余的劃痕或損傷瓊脂表面，以免影響菌落生長(zhǎng)和溶血圈的形態(tài)。
4、培養(yǎng)條件
溫度：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)溫度為36±1℃。溫度過(guò)高（如 37-38℃）可能抑制溶血素 LLO 的產(chǎn)生，導(dǎo)致溶血圈不明顯或消失；溫度過(guò)低（如 30℃以下）則可能影響細(xì)菌生長(zhǎng)。
時(shí)間：培養(yǎng)時(shí)間通常為24-48 小時(shí)。培養(yǎng)時(shí)間不足，溶血素產(chǎn)生量少，溶血圈不清晰；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，溶血素可能被細(xì)菌自身分解，或其他雜菌的生長(zhǎng)可能干擾觀察。
氣體環(huán)境：通常為需氧條件。
5、結(jié)果觀察與判讀
觀察時(shí)機(jī)：在培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后，立即在明亮處觀察平板。
判讀標(biāo)準(zhǔn)：
β 溶血：菌落周圍出現(xiàn)清晰、透明、界限分明的亮區(qū)，這是單增李斯特菌的典型特征。
與其他李斯特菌的區(qū)別：
伊氏李斯特菌 (L. ivanovii)：通常表現(xiàn)為寬的、模糊的 β 溶血圈。
斯氏李斯特菌 (L. seeligeri)：可能表現(xiàn)為弱的 β 溶血。
對(duì)照設(shè)置：每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（如已知的
單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株）和陰性對(duì)照（如已知的
英諾克李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株），以確保實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的可靠性。
6、其他注意事項(xiàng)
污染排查：如果平板上出現(xiàn)雜菌生長(zhǎng)，應(yīng)視為無(wú)效實(shí)驗(yàn)，需重新進(jìn)行。
結(jié)果記錄：詳細(xì)記錄溶血圈的大小、形態(tài)、顏色等特征。
二、協(xié)同溶血試驗(yàn)（CAMP 試驗(yàn)）的注意事項(xiàng)
CAMP 試驗(yàn)是確證試驗(yàn)，利用金葡菌產(chǎn)生的 β 溶血素（SLO）與
單增李斯特菌的 LLO 協(xié)同作用，在兩菌劃線之間形成一個(gè)獨(dú)特的箭頭狀或扇形溶血增強(qiáng)區(qū)。
1、培養(yǎng)基的選擇與制備
與溶血試驗(yàn)相同：同樣要求使用新鮮的羊血瓊脂平板，并確保血液質(zhì)量良好、平板狀態(tài)正常。
2、菌株的準(zhǔn)備
待測(cè)菌：使用新鮮的、純培養(yǎng)的單菌落。
指示菌（金葡菌/馬紅球菌）：
金葡菌 (Staphylococcus aureus,
ATCC 25923)：是標(biāo)準(zhǔn)的指示菌，其產(chǎn)生的 β 溶血素（SLO）活性穩(wěn)定，能有效增強(qiáng)單增李斯特菌的溶血。
馬紅球菌 (Rhodococcus equi,
ATCC 33270)：有時(shí)也用于增強(qiáng)伊氏李斯特菌的溶血。
指示菌必須新鮮：應(yīng)使用在血瓊脂平板上 36±1℃培養(yǎng) 18-24 小時(shí)的新鮮培養(yǎng)物，以保證其 β 溶血素的活性。
3、接種方法
劃線方式：
在平板中央，用接種環(huán)以平行劃線的方式，分別劃兩條線，間距約 3-4 厘米。一條線接種金葡菌（或
馬紅球菌），另一條線作為空白或不接種。
待劃線的指示菌干后，用接種環(huán)挑取待測(cè)菌的純菌落，在兩條指示菌劃線之間，以垂直劃線的方式進(jìn)行接種。劃線的兩端不要與指示菌劃線接觸。
劃線力度：劃線要均勻、清晰，力度適中，確保細(xì)菌能在平板上良好生長(zhǎng)。
4、培養(yǎng)條件
溫度：通常推薦在 **30℃** 下培養(yǎng) 24-48 小時(shí)。較低的溫度（30℃）可以優(yōu)化 CAMP 因子的產(chǎn)生和協(xié)同溶血效應(yīng)，使增強(qiáng)區(qū)更加明顯。
時(shí)間：24-48 小時(shí)。
氣體環(huán)境：需氧條件。
5、結(jié)果觀察與判讀
觀察時(shí)機(jī)：培養(yǎng)結(jié)束后，立即在明亮處觀察平板。
判讀標(biāo)準(zhǔn)：
單增李斯特菌：在靠近金葡菌劃線的一側(cè)，與金葡菌劃線形成一個(gè)清晰的、呈箭頭狀或扇形的溶血增強(qiáng)區(qū)。這個(gè)增強(qiáng)區(qū)通常在兩菌之間距離金葡菌劃線約 2 毫米處開(kāi)始出現(xiàn)。
伊氏李斯特菌：在靠近馬紅球菌劃線的一側(cè)，與馬紅球菌劃線形成一個(gè)更寬的、呈箭頭狀或扇形的溶血增強(qiáng)區(qū)。
斯氏李斯特菌：可能在靠近金葡菌劃線的一側(cè)出現(xiàn)較弱的溶血增強(qiáng)區(qū)。
對(duì)照設(shè)置：每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（如已知的單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株）和陰性對(duì)照（如已知的英諾克李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株）。
6、其他注意事項(xiàng)
指示菌的選擇：必須使用標(biāo)準(zhǔn)菌株（如
ATCC 25923），以確保其 β 溶血素活性穩(wěn)定。
劃線間距：待測(cè)菌與指示菌劃線之間的距離應(yīng)控制在 1-2 厘米，過(guò)近或過(guò)遠(yuǎn)都會(huì)影響協(xié)同效應(yīng)的觀察。
避免接觸：待測(cè)菌的劃線兩端絕對(duì)不能與指示菌的劃線接觸，否則會(huì)導(dǎo)致兩菌直接接觸，可能產(chǎn)生非特異性的溶血或抑制。
結(jié)果記錄：詳細(xì)記錄溶血增強(qiáng)區(qū)的位置、形態(tài)、大小等特征。
三、通用注意事項(xiàng)與質(zhì)量控制
1、生物安全：
單增李斯特菌是食源性致病菌，具有潛在的致病性，尤其是對(duì)孕婦、新生兒、老年人和免疫功能低下人群。
所有實(shí)驗(yàn)操作必須在生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。
操作人員必須穿戴個(gè)人防護(hù)裝備（PPE），包括手套、口罩、實(shí)驗(yàn)服等。
實(shí)驗(yàn)器材和廢棄物必須按照生物安全規(guī)定進(jìn)行處理和滅菌。
2、質(zhì)量控制（QC）：
對(duì)照菌株：每次實(shí)驗(yàn)都必須使用已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和可靠性。
培養(yǎng)基質(zhì)量驗(yàn)證：定期對(duì)新批次的培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量驗(yàn)證，確保其無(wú)菌、成分合格、性能穩(wěn)定。
菌株保藏：標(biāo)準(zhǔn)菌株應(yīng)定期傳代和保藏，以確保其純度和活性。
記錄與追溯：詳細(xì)記錄所有實(shí)驗(yàn)的操作步驟、條件、結(jié)果和觀察到的現(xiàn)象，以便于結(jié)果的分析和追溯。
3、人員培訓(xùn)：
操作人員必須接受過(guò)專業(yè)的微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)，熟悉相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）。
4、結(jié)果報(bào)告：
溶血試驗(yàn)和 CAMP 試驗(yàn)的結(jié)果必須結(jié)合其他生化試驗(yàn)（如觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、VP 試驗(yàn)等）和血清學(xué)試驗(yàn)等進(jìn)行綜合分析，才能得出最終的鑒定結(jié)論。
報(bào)告結(jié)果時(shí)應(yīng)注明實(shí)驗(yàn)條件、使用的菌株和培養(yǎng)基等信息。
遵循以上注意事項(xiàng)，可以最大限度地減少實(shí)驗(yàn)誤差，提高
單增李斯特菌鑒定的準(zhǔn)確性和可靠性。
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