革蘭氏染色液的原理與實驗現(xiàn)象及常見問題與注意事項！
小楊 / 2025-12-30 09:55:08
百歐博偉生物：革蘭氏染色法是一種經(jīng)典的細菌分類鑒別技術，通過細胞壁結構差異將細菌分為革蘭氏陽性菌（G?）和革蘭氏陰性菌（G?）。其核心原理基于細胞壁肽聚糖層的厚度和結構差異，導致對染料的保留能力不同。
一、核心原理
革蘭氏染色的關鍵在于結晶紫 - 碘復合物（CV-I）能否被酒精洗脫。這一差異源于兩種細菌細胞壁的根本區(qū)別：
特征 革蘭氏陽性菌 (G?) 革蘭氏陰性菌 (G?)
細胞壁結構 厚（20-80 nm），主要由肽聚糖層和磷壁酸組成。 ?。?0-15 nm），肽聚糖層外有外膜（脂多糖、脂蛋白等）。
肽聚糖交聯(lián)度 高，結構致密。 低，結構疏松。
酒精作用 肽聚糖層脫水收縮，孔徑變小，CV-I 復合物無法被洗脫。 外膜被酒精溶解，肽聚糖層結構松散，CV-I 復合物被洗脫。
最終顏色 紫色（結晶紫的顏色）。 紅色或粉紅色（番紅的顏色）。
染色過程的化學反應：
初染：結晶紫（堿性染料）與細菌細胞質中的酸性成分結合，使所有細菌均染成紫色。
媒染：碘液（I?）與結晶紫結合形成結晶紫 - 碘復合物（CV-I），增強染料與細菌的結合力。
脫色：95% 乙醇作為脫色劑。G?菌因細胞壁致密，CV-I 復合物被保留；G?菌因外膜被溶解，CV-I 復合物被洗脫。
復染：番紅（堿性染料）對脫色后的 G?菌進行染色，使其呈現(xiàn)紅色。G?菌已被結晶紫染色，不再吸收番紅。
二、實驗現(xiàn)象
在顯微鏡下觀察染色后的細菌，會呈現(xiàn)出兩種截然不同的顏色：
革蘭氏陽性菌 (G?)：被染成藍紫色。
革蘭氏陰性菌 (G?)：被染成紅色或粉紅色。
常見例子：
大腸桿菌 (Escherichia coli)、
沙門氏菌 (Salmonella)、
志賀氏菌 (Shigella)、
霍亂弧菌 (Vibrio cholerae)。
三、常見問題與注意事項
革蘭氏染色的結果準確性對實驗操作要求極高，以下是一些關鍵的注意事項：
菌齡：
G?菌：應使用對數(shù)生長期的培養(yǎng)物（培養(yǎng) 18-24 小時）。若菌齡過老，其細胞壁會發(fā)生老化、破裂，肽聚糖層結構被破壞，可能導致染色結果出現(xiàn)假陰性（原本應為紫色，結果染成紅色）。
G?菌：菌齡影響相對較小，但同樣建議使用對數(shù)生長期的培養(yǎng)物。
涂片質量：
涂片必須薄而均勻。過厚的涂片會導致脫色不均，影響結果判斷。
涂片應在酒精燈火焰上固定，固定的目的是殺死細菌并使其牢固附著在載玻片上。固定時溫度不宜過高，時間不宜過長，以免破壞細菌形態(tài)。
染色時間：
初染（結晶紫）：1 分鐘。
水洗：用流水緩慢沖洗，直至流出的水無色為止。
媒染（碘液）：1 分鐘。
水洗：同上。
脫色（95% 乙醇）：這是最關鍵的步驟，時間需嚴格控制。一般為20-30 秒。脫色時間過短，G?菌脫色不完全，可能出現(xiàn)假陽性；脫色時間過長，G?菌脫色過度，可能出現(xiàn)假陰性。應根據(jù)實際情況靈活調整。
水洗：同上。
復染（番紅）：30 秒 - 1 分鐘。
水洗：同上。
干燥與鏡檢：用吸水紙吸干載玻片上的水分，或在酒精燈火焰上方輕輕烘干（切勿高溫烘烤），然后進行鏡檢。
試劑質量：
結晶紫、碘液、番紅等試劑需確保新鮮有效。碘液若存放過久，碘會揮發(fā)，導致媒染效果不佳。
鏡檢：
觀察時應使用油鏡（100× 物鏡）。
先在低倍鏡下找到目標區(qū)域，再換高倍鏡和油鏡進行觀察。
注意區(qū)分細菌的真實形態(tài)和染色過程中可能出現(xiàn)的假象。
總結
革蘭氏染色法通過顏色差異快速區(qū)分 G?和 G?菌，其原理是基于細胞壁結構對染料的不同保留能力。實驗成功的關鍵在于嚴格控制菌齡、涂片質量、染色時間（尤其是脫色步驟）以及試劑的有效性。準確的革蘭氏染色結果是后續(xù)細菌鑒定和分類的重要基礎。
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