小鼠子宮成纖維細(xì)胞的分離與培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)流程及注意事項(xiàng)！
小楊 / 2026-02-11 11:21:34
小鼠子宮成纖維細(xì)胞的原代分離與培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)流程，偏實(shí)操、步驟清晰、含關(guān)鍵質(zhì)控點(diǎn)，適合寫(xiě)實(shí)驗(yàn)方案/直接操作。
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
器材：超凈臺(tái)、解剖剪 / 鑷、15/50 mL 離心管、細(xì)胞篩（70 μm）、培養(yǎng)皿/瓶
試劑：
無(wú)菌 PBS（不含鈣鎂）
0.25% Trypsin-EDTA
Ⅱ 型膠原酶（Collagenase Ⅱ，1 mg/mL 左右）
完全培養(yǎng)基：DMEM/F12 + 10% FBS + 1% 雙抗（Pen/Strep）
動(dòng)物：6–8 周齡健康小鼠（雌、未孕常用），處死消毒后開(kāi)腹取子宮。
二、組織取材（關(guān)鍵：快速、無(wú)菌、低溫）
小鼠頸椎脫臼處死，75% 乙醇浸泡消毒。
開(kāi)腹，取出雙側(cè)完整子宮，放入預(yù)冷無(wú)菌 PBS 中。
剔除脂肪、系膜、血管，用 PBS 沖洗 2–3 遍，去除血跡與黏液。
將子宮縱向剪開(kāi)，暴露宮腔面，PBS 輕洗，去除內(nèi)膜殘留黏液。
三、組織消化（推薦：膠原酶 + 胰酶兩步消化）
將子宮剪成 1 mm³ 左右碎塊，移入 15 mL 離心管。
加入預(yù)熱的 Collagenase Ⅱ（1 mg/mL），37 ℃消化 30–40 min，期間每 5 min 輕彈混勻。
加入等體積 0.25% Trypsin-EDTA，繼續(xù) 37 ℃消化 10–15 min。
加入完全培養(yǎng)基（含血清）終止消化，反復(fù)吹打打散。
四、過(guò)濾、離心、去除雜質(zhì)
消化懸液經(jīng) 70 μm 細(xì)胞篩過(guò)濾，去除未消化組織塊。
室溫 1000–1500 rpm，5 min 離心，棄上清。
用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種到培養(yǎng)瓶/皿。
五、差速貼壁純化成纖維細(xì)胞（最關(guān)鍵步驟）
子宮組織含上皮、基質(zhì)、免疫細(xì)胞，必須純化：
接種后放入 37 ℃、5% CO? 培養(yǎng)箱。
首次換液：6–8 h（只讓成纖維細(xì)胞貼壁，上皮/血細(xì)胞懸浮）。
吸走懸浮液，PBS 輕洗 1 遍，加新鮮完全培養(yǎng)基。
此后每 24–48 h 換液一次。
結(jié)果：24–48 h 可見(jiàn)大量梭形、放射狀生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞；上皮細(xì)胞多為多角形、片狀，可通過(guò)再次差速貼壁去除。
六、常規(guī)培養(yǎng)與傳代
1、培養(yǎng)條件
培養(yǎng)基：DMEM/F12 + 10% FBS + 雙抗
環(huán)境：37 ℃、5% CO?、飽和濕度
2、傳代時(shí)機(jī)
細(xì)胞融合度 80%–90% 傳代
原代一般 3–5 天可傳代
3、傳代步驟
棄培養(yǎng)基，PBS 洗 1 遍。
加 0.25% Trypsin-EDTA，37 ℃消化 1–2 min，鏡下見(jiàn)細(xì)胞收縮變圓即終止。
加完全培養(yǎng)基吹打，離心（1000 rpm，5 min），棄上清。
重懸，按 1:2 或 1:3 傳代。
4、凍存
凍存液：90% FBS + 10% DMSO
程序降溫盒 → -80 ℃過(guò)夜 → 液氮長(zhǎng)期保存
七、細(xì)胞鑒定（判斷是否為子宮成纖維細(xì)胞）
標(biāo)準(zhǔn)鑒定組合：
Vimentin（+）：間充質(zhì)/成纖維細(xì)胞標(biāo)志
Cytokeratin（CK，–）：排除上皮細(xì)胞
α-SMA（弱/部分 +）：部分肌成纖維表型正常
形態(tài)：典型長(zhǎng)梭形、漩渦狀生長(zhǎng)
八、常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)（必看）
污染高發(fā)：子宮腔與外界相通，取材要快、沖洗充分、雙抗?jié)舛瓤膳R時(shí)略高。
1、上皮細(xì)胞過(guò)多：
縮短首次貼壁時(shí)間（4–6 h）
傳代時(shí)再次利用差速貼壁純化
2、細(xì)胞不貼壁/生長(zhǎng)慢：
消化過(guò)度 → 縮短胰酶時(shí)間
FBS 質(zhì)量差 → 更換優(yōu)質(zhì)胎牛血清
3、原代不要養(yǎng)太高代數(shù)
建議 P3 以?xún)?nèi)用于實(shí)驗(yàn)，表型最穩(wěn)定
九、極簡(jiǎn)流程速記（方便寫(xiě)方案）
取材 → 剪碎 → 膠原酶 + 胰酶消化 → 過(guò)濾離心 → 接種 → 6–8 h 差速貼壁純化 → 常規(guī)培養(yǎng) → 傳代 → 鑒定（Vimentin+）
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司的
微生物菌種查詢(xún)網(wǎng)提供微生物菌種保藏、測(cè)序、購(gòu)買(mǎi)等服務(wù),是中國(guó)微生物菌種保藏中心的服務(wù)平臺(tái)，并且是集微生物菌種、菌種,ATCC菌種、細(xì)胞、培養(yǎng)基為一體的大型微生物查詢(xún)類(lèi)網(wǎng)站，自設(shè)設(shè)備及技術(shù)的微生物菌種保藏中心！歡迎廣大客戶(hù)來(lái)詢(xún)！
下載附件
上一篇：平板制備過(guò)程中如何避免產(chǎn)生氣泡？具體該怎么操作呢？
下一篇：沙門(mén)氏菌血清學(xué)鑒定的操作流程與注意事項(xiàng)及應(yīng)用場(chǎng)景！