瓊脂稀釋法的實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備與操作步驟及常見問題與解決！
小楊 / 2026-02-12 10:09:54
百歐博偉生物：瓊脂稀釋法的操作流程核心是“藥物梯度制備→含藥平板制備→菌液標(biāo)準(zhǔn)化→接種培養(yǎng)→結(jié)果判讀”，全程需嚴(yán)格控制無菌操作、濃度準(zhǔn)確性和培養(yǎng)條件，以確保最低抑菌濃度（MIC）結(jié)果可靠。以下是基于 CLSI/EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)程的詳細(xì)操作步驟：
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（核心：材料合規(guī) + 無菌環(huán)境）
1、試劑與材料準(zhǔn)備
類別 具體物品及要求
抗菌藥物 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%），按目標(biāo)藥物的 CLSI/EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)確定濃度梯度
培養(yǎng)基 需氧菌用 MH 瓊脂，pH 7.2~7.4；厭氧菌用布氏瓊脂；真菌用 RPMI 1640 瓊脂（含 2% 葡萄糖）
菌液制備工具 0.5 麥?zhǔn)媳葷峁埽ɑ虮葷醿x）、無菌生理鹽水/MH 肉湯、1000 μL/100 μL 微量移液器（校準(zhǔn)后使用）
接種工具 多點(diǎn)接種儀（推薦，8~12 點(diǎn)/板）或 3mm 無菌接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿（直徑 90mm）
2、儀器設(shè)備準(zhǔn)備
恒溫培養(yǎng)箱（35±2℃）、厭氧培養(yǎng)箱（厭氧菌專用）、超凈工作臺(tái)；
高壓蒸汽滅菌鍋（培養(yǎng)基滅菌，121℃、15min）、干熱滅菌箱（玻璃器皿滅菌，160℃、2h）；
渦旋振蕩器（菌液混勻）、移液器（校準(zhǔn)誤差≤5%）。
3、環(huán)境要求
全程在超凈工作臺(tái)進(jìn)行，工作臺(tái)需提前紫外消毒 30min，操作前用 75% 乙醇擦拭臺(tái)面；
實(shí)驗(yàn)人員穿戴無菌手套、口罩、實(shí)驗(yàn)服，避免交叉污染。
二、核心操作步驟（分 5 步，含關(guān)鍵控制點(diǎn)）
步驟 1：抗菌藥物梯度稀釋（確保濃度準(zhǔn)確，無溶劑干擾）
儲(chǔ)備液制備：
用適宜溶劑溶解藥物標(biāo)準(zhǔn)品，配制成高濃度儲(chǔ)備液，溶劑占比≤1%（避免抑制微生物生長）。分裝后 - 20℃避光保存，有效期 3~6 個(gè)月（不穩(wěn)定藥物如 β- 內(nèi)酰胺類需現(xiàn)配現(xiàn)用）。
工作液梯度稀釋：
取儲(chǔ)備液用 MH 肉湯進(jìn)行倍比稀釋，制備所需濃度梯度（如 8 個(gè)濃度點(diǎn)：0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16 μg/mL），每管體積 1 mL。稀釋時(shí)用渦旋振蕩器混勻（每步振蕩 10~15 秒），避免濃度不均。
空白對(duì)照液：
設(shè) 1 管不含藥物的 MH 肉湯（1 mL），用于制備空白瓊脂平板（驗(yàn)證菌液活性）。
步驟 2：含藥瓊脂平板制備（藥物與瓊脂均勻混合，避免藥物降解）
培養(yǎng)基融化與冷卻：
取 MH 瓊脂（每板需 9 mL）加熱融化，冷卻至 45~50℃（手感不燙手，用溫度計(jì)校準(zhǔn)，避免高溫破壞藥物活性）。
藥物與瓊脂混合：
向 9 mL 融化的 MH 瓊脂中快速加入 1 mL 藥物工作液，立即顛倒混勻（3~5 次，避免氣泡），迅速倒入無菌培養(yǎng)皿（每皿約 20 mL），水平放置在超凈工作臺(tái)中待凝固（室溫 1~2h 或 4℃冷藏 30min）。
平板標(biāo)記與保存：
每板標(biāo)記藥物名稱、濃度、制備日期；凝固后的平板 4℃密封保存（含不穩(wěn)定藥物的平板需現(xiàn)配現(xiàn)用），有效期≤7 天。
空白對(duì)照平板：
向 9 mL MH 瓊脂中加入 1 mL 空白對(duì)照液，同上制備空白平板（用于驗(yàn)證菌液是否正常生長）。
步驟 3：菌液標(biāo)準(zhǔn)化制備（控制接種菌量，核心影響結(jié)果準(zhǔn)確性）
純菌落活化：
從新鮮培養(yǎng)（16~20h）的純培養(yǎng)平板上，挑取 3~5 個(gè)形態(tài)一致的單菌落，接種至 5 mL MH 肉湯中，35℃振蕩培養(yǎng) 4~6h（細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期，確?；钚砸恢拢?。
濃度校準(zhǔn)：
取活化后的菌液，用無菌生理鹽水稀釋至0.5 麥?zhǔn)蠁挝唬ㄏ喈?dāng)于 1.5×10? CFU/mL），或用比濁儀直接測定（誤差≤10%）。稀釋后菌液需在 15min 內(nèi)使用，避免細(xì)菌死亡。
最終稀釋（關(guān)鍵）：
將 0.5 麥?zhǔn)蠁挝痪河?MH 肉湯稀釋 100 倍，得到 1.5×10? CFU/mL 的菌液（最終接種量需控制在 10? CFU /點(diǎn)，確保生長抑制僅由藥物濃度決定）。
步驟 4：接種與培養(yǎng)（均勻接種，適宜培養(yǎng)條件）
接種方式選擇：
多點(diǎn)接種儀（推薦）：將標(biāo)準(zhǔn)化菌液加入接種儀樣品池，每塊含藥平板可接種 8~12 個(gè)菌株，每個(gè)菌株接種 1~2 μL（相當(dāng)于 10? CFU /點(diǎn)），接種點(diǎn)直徑≤5mm，避免劃破瓊脂表面。
接種環(huán)：用無菌接種環(huán)（直徑 3mm）蘸取菌液，在平板表面點(diǎn)種，每點(diǎn)接種量約 1 μL，接種后輕輕劃開（不劃破瓊脂），確保菌液均勻分布。
培養(yǎng)條件設(shè)置：
需氧菌：35±2℃，有氧培養(yǎng) 16~20h（避免超過 24h，防止菌落過度生長影響判讀）；
厭氧菌：35±2℃，厭氧環(huán)境（85% N?、10% H?、5% CO?）培養(yǎng) 48h；
真菌：35℃，有氧培養(yǎng) 24~48h（念珠菌）或 72h（曲霉）。
培養(yǎng)注意事項(xiàng)：
接種后平板倒置培養(yǎng)（避免冷凝水滴落污染菌落），培養(yǎng)期間不頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱，保持溫度穩(wěn)定（波動(dòng)≤±1℃）。
步驟 5：結(jié)果判讀（統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，避免主觀誤差）
先驗(yàn)證空白對(duì)照：
空白平板需出現(xiàn)明顯、均勻的菌落生長（菌落直徑≥1mm），若無菌落生長，說明菌液失效或培養(yǎng)基抑制生長，實(shí)驗(yàn)需重新進(jìn)行。
MIC 值判讀標(biāo)準(zhǔn)：
細(xì)菌：以“完全抑制可見生長（僅允許單個(gè)菌落或輕微菌膜，面積≤接種點(diǎn)的 10%）”的最低藥物濃度為 MIC；
真菌：念珠菌以“菌落直徑≤1mm”的最低濃度為 MIC，曲霉以“無可見菌絲生長”的最低濃度為 MIC。
結(jié)果轉(zhuǎn)化與記錄：
按 CLSI/EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)將 MIC 值轉(zhuǎn)化為“敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）”，例如：大腸桿菌對(duì)頭孢他啶的 MIC≤2 μg/mL 為敏感，≥8 μg/mL 為耐藥。
異常結(jié)果處理：
若出現(xiàn)“跳孔生長”（低濃度抑制、高濃度生長）、所有濃度均無抑制或均完全抑制，需排查藥物濃度、菌液純度、培養(yǎng)基質(zhì)量等問題，重新實(shí)驗(yàn)。
三、操作關(guān)鍵控制點(diǎn)（確保結(jié)果重復(fù)性的核心）
藥物濃度準(zhǔn)確性：
稀釋用移液器需定期校準(zhǔn)，每步稀釋體積誤差≤5%；
熱不穩(wěn)定藥物需過濾除菌（0.22 μm 濾膜），避免高壓滅菌降解。
接種菌量控制：
定期用傾注平板法計(jì)數(shù)接種后的菌液濃度，確保實(shí)際接種量在 10?±30% CFU/點(diǎn)；
菌液制備后 15min 內(nèi)完成接種，避免細(xì)菌死亡或增殖導(dǎo)致濃度偏差。
培養(yǎng)基質(zhì)量：
融化后瓊脂需澄清透明，無沉淀、顆粒；pH 嚴(yán)格控制在 7.2~7.4（需氧菌），誤差≤0.2；
每批培養(yǎng)基隨機(jī)取 3~5 皿做無菌性驗(yàn)證（35℃培養(yǎng) 24h 無雜菌生長）。
質(zhì)控菌株驗(yàn)證：
每批實(shí)驗(yàn)需同時(shí)接種標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株（如
ATCC 25922），其 MIC 值需在 CLSI 規(guī)定的參考范圍內(nèi)（如
ATCC 25922 對(duì)氨芐西林的 MIC 參考范圍 4~16 μg/mL），否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效。
四、常見操作失誤與糾正措施
操作失誤 可能后果 糾正措施
藥物工作液稀釋時(shí)未混勻 平板藥物濃度不均，MIC 值偏差 每步稀釋后用渦旋振蕩器振蕩 10~15 秒，確?；靹?/div>
瓊脂溫度過高（＞50℃）加藥物 藥物降解，抑制活性下降 用溫度計(jì)校準(zhǔn)瓊脂溫度，冷卻至 45~50℃再加藥物
菌液稀釋后放置時(shí)間過長（＞15min） 細(xì)菌死亡，接種菌量不足 菌液標(biāo)準(zhǔn)化后立即接種，避免長時(shí)間放置
接種時(shí)劃破瓊脂表面 菌落擴(kuò)散，判讀困難 控制接種力度，多點(diǎn)接種儀針頭高度調(diào)至與瓊脂表面平行
培養(yǎng)時(shí)間過長（＞24h） 菌落過度生長，掩蓋抑制效果 嚴(yán)格按 CLSI 標(biāo)準(zhǔn)控制培養(yǎng)時(shí)間（細(xì)菌 16~20h）
五、總結(jié)
瓊脂稀釋法的操作核心是“標(biāo)準(zhǔn)化” 和 “無菌化”：從藥物梯度的精準(zhǔn)制備、菌液濃度的嚴(yán)格校準(zhǔn)，到接種、培養(yǎng)、判讀的規(guī)范執(zhí)行，每個(gè)環(huán)節(jié)都需遵循 CLSI/EUCAST 標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)通過質(zhì)控菌株驗(yàn)證和操作過程質(zhì)控，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。該流程適用于臨床致病菌藥敏檢測、新藥抗菌活性篩選等場景，是微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化操作的核心技術(shù)之一。
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