一、背景
人羊膜細胞起源是正常羊膜，但隨后通過同工酶分析、HeLA標記染色體和DNA指紋法分析，WISH細胞的起源是HeLa細胞污染的。WISH細胞角蛋白免疫過氧化物酶染色陽性。注意：WISH細胞包含HeLa標記染色體，是從HeLa污染細胞中建株的。
二、人羊膜細胞培養(yǎng)步驟
1、復蘇人羊膜細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓毎麘乙杭尤?cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。
2、人羊膜細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。
a）、對于貼壁人羊膜細胞，傳代可參考以下方法：
1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。
3.輕輕吹打細胞，完全脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。
4.按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細胞懸液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。
3、人羊膜細胞凍存：
（1）細胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細胞一次；
（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
（3）用適量的凍存液重懸細胞，并放置于凍存管中；
（4）先將細胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃。
三、應(yīng)用
人羊膜細胞可以用于人羊膜細胞的原代培養(yǎng)和在Ⅰ型膠原蛋白支架上的三維培養(yǎng)用于修復胎膜破口的研究：
建立人羊膜上皮細胞和羊膜間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)和細胞純化的方法;選擇促進人羊膜細胞增殖的最佳培養(yǎng)基;構(gòu)建人羊膜細胞/Ⅰ型膠原蛋白支架復合物以用于修復胎膜破口的研究。
方法：
1、通過酶消化法對羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞進行分離和純化。應(yīng)用免疫細胞化學方法對人羊膜上皮細胞和羊膜間質(zhì)細胞進行細胞鑒定。
2、利用分光光度劑測定人羊膜細胞在4種不同的培養(yǎng)基下的細胞增殖狀況。Ⅰ組:DMEM/F12+10%FBS+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰島素+5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+0.1ng/ml T3;Ⅱ組:DMEM/F12+10%FBS;Ⅲ組:DMEM/F12+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰島素+5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+0.1ng/ml T3;Ⅳ組:DMEM/F12+50.0ng/mlEGF。
3、將羊膜間質(zhì)細胞嵌入三維基質(zhì)中,羊膜上皮細胞接種在基質(zhì)的表面,構(gòu)建人羊膜細胞/Ⅰ型膠原蛋白支架復合物以模擬人體羊膜組織結(jié)構(gòu)。
4、DAPI標記三維基質(zhì)中的細胞核以計數(shù)人羊膜細胞在三維培養(yǎng)第2,8天的細胞數(shù)量。耦合羅丹明的鬼筆環(huán)肽染色標記可特異性地顯示細胞骨架中的微絲(F-actin)結(jié)構(gòu)以觀察細胞在三維基質(zhì)中的細胞形態(tài)。掃描電鏡和透射電鏡觀察羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞在三維培養(yǎng)中的超微結(jié)構(gòu)。
5、培養(yǎng)含有不同數(shù)量羊膜間質(zhì)細胞的人羊膜細胞/Ⅰ型膠原蛋白支架復合物,15 d后檢測抗張強度。
結(jié)果：
1、采用胰蛋白酶和膠原酶先后消化的方法可以將羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞進行細胞分離培養(yǎng)。人羊膜細胞體外培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的細胞增殖能力和傳代能力。
2、羊膜間質(zhì)細胞在缺少胎牛血清的培養(yǎng)基里缺乏增殖能力。人羊膜細胞在含有胎牛血清、表皮生長因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及三碘甲腺原氨酸的培養(yǎng)基里表現(xiàn)出較其余3組更強的細胞增殖能力(P<0.001)。(羊膜上皮細胞Ⅰ組:1.130±0.203;Ⅱ組:0.487±0.141;Ⅲ組:0.466±0.094;Ⅳ組:0.451±0.144。羊膜間質(zhì)細胞Ⅰ組:1.356±0.173;Ⅱ組:0.930±0.112;Ⅲ組:0.200±0.053;Ⅳ組:0.190±0.029)。
3、人羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞在Ⅰ型膠原蛋白基質(zhì)中的培養(yǎng)顯示出與體內(nèi)人羊膜細胞的相似性,人羊膜細胞在三維培養(yǎng)的過程中細胞數(shù)量無明顯增加,人羊膜間質(zhì)細胞可導致Ⅰ型膠原蛋白的收縮,抑肽酶和GM6001也不能抑制這種收縮。
4、人羊膜細胞/Ⅰ型膠原蛋白復合物抗張強度隨人羊膜間質(zhì)細胞數(shù)量的增多而增強(P<0.001)。
結(jié)論：
1、羊膜上皮細胞和間質(zhì)細胞能夠在體外分離、擴增,這為運用人羊膜細胞進行細胞治療和組織工程技術(shù)奠定了實驗基礎(chǔ)。
2、Ⅰ型膠原蛋白有望應(yīng)用在人羊膜細胞組織工程,三維細胞基質(zhì)培養(yǎng)系統(tǒng)有望為胎膜早破提供新的研究方法和治療手段。
北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司擁有對菌種、細胞、培養(yǎng)基、配套試劑等產(chǎn)品需求者的極優(yōu)質(zhì)服務(wù)，對購買項目的前期資料提供,中期合同保證,后期貨物跟蹤到最終售后的確保項目準確到位，都有相關(guān)人士進行維護,確保您在微生物菌種查詢網(wǎng)中獲得最優(yōu)質(zhì)服務(wù)！也正因為此，北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司與國內(nèi)外多家研制單位、生物制藥、第三方檢測機構(gòu)和科研院所院校、化工企業(yè)有著良好、長期和穩(wěn)定的合作關(guān)系！