一、背景
NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系是由Gazdar AF等在1982年建系而來，源于鱗狀細(xì)胞肺癌組織；NCI-H520細(xì)胞p53 mRNA表達水平較正常肺組織低，但是沒有大的結(jié)構(gòu)DNA的異常。NCI-H520細(xì)胞角蛋白、波形蛋白陽性，神經(jīng)絲三聯(lián)蛋白陰性；NCI-H520細(xì)胞在軟瓊脂中可形成克隆。
二、NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考：
1、NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞復(fù)蘇
1）配制NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細(xì)胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細(xì)胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺中，化凍的細(xì)胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細(xì)胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細(xì)胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細(xì)胞貼壁情況（未貼壁的即為死細(xì)胞--針對貼壁細(xì)胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞傳代
1）待細(xì)胞生長到80%-90%匯合度時，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細(xì)胞消化時間不同），取出細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞至細(xì)胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細(xì)胞脫落下來成單個細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細(xì)胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細(xì)胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系細(xì)胞凍存
1）按照細(xì)胞傳代方法，在超凈工作臺內(nèi)消化收集細(xì)胞沉淀，取少量細(xì)胞用于計數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
三、應(yīng)用
NCI-H520人肺腺鱗癌貼壁細(xì)胞系可以用于左卡尼汀對多西他賽抑制NCI-H520細(xì)胞增殖作用影響的研究：
探究心臟保護劑左卡尼汀(L-carnitine,L-CNT)對化療藥物多西他賽(Docetaxel,DTX)抑制肺癌細(xì)胞NCI-H520增殖作用的影響,并初步探索L-CNT影響DTX抗腫瘤作用的機制。
方法：
1、實驗藥物濃度的確定采用MTT法分別測定不同濃度的L-CNT和DTX在24小時對NCI-H520細(xì)胞增殖活性的影響,根據(jù)MTT的結(jié)果確定實驗所采用的L-CNT和DTX的作用濃度。其中L-CNT的濃度范圍為2.5、10、40、80μg·mL-1,DTX的濃度范圍為0.25、2.5、5、10、25、50、100、200μg·mL-1。
2、L-CNT對DTX抑制NCI-H520細(xì)胞增殖的影響將NCI-H520細(xì)胞分為四組進行實驗,分別為對照組(Control)、L-CNT組、DTX組以及聯(lián)合用藥組(L-CNT+DTX)。采用MTT法檢測NCI-H520細(xì)胞增殖情況,倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
3、L-CNT對DTX誘導(dǎo)NCI-H520細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化的影響采用Annexin V-FITC/PI雙染法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測NCI-H520細(xì)胞凋亡情況,PI單染檢測細(xì)胞周期。
4、L-CNT影響DTX在NCI-H20細(xì)胞中抗腫瘤作用的機制研究。采用Western blot法檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p53以及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達。
結(jié)果：
1、確定L-CNT和DTX的實驗濃度MTT的實驗結(jié)果顯示,L-CNT在2.5-80μg·mL-1濃度范圍內(nèi),對NCI-H520細(xì)胞的增殖無明顯影響,各組間的細(xì)胞增殖率沒有統(tǒng)計學(xué)差異。而DTX在0.25-200μg·mL-1濃度范圍內(nèi),對NCI-H520細(xì)胞增殖的抑制表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性,且隨濃度的增加,抑制作用增強。DTX在24h的IC50值為40μg·mL-1。結(jié)合臨床患者L-CNT用藥劑量,確定L-CNT和DTX的實驗濃度分別為80μg·mL-1和40μg·mL-1,實驗時間為24h。
2、L-CNT能夠增強DTX對NCI-H520細(xì)胞增殖的抑制作用倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,Control組和L-CNT(80μg·mL-1)組的細(xì)胞間連接緊密,細(xì)胞輪廓清晰飽滿,兩組無明顯差別,DTX(40μg·mL-1)組細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、胞質(zhì)空泡化,細(xì)胞間隙變大,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)組細(xì)胞間隙進一步增加,細(xì)胞數(shù)量減少。MTT結(jié)果顯示,Control組和L-CNT(80μg·mL-1)組的增殖率無明顯變化。與DTX(40μg·mL-1)組相比,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)組的增殖率由65.73±2.22%下降到54.4±1.67%(P<0.05)。
3、L-CNT通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期增強DTX對NCI-H520細(xì)胞增殖的抑制作用細(xì)胞凋亡的實驗結(jié)果顯示,在24h,與Control組相比,L-CNT(80μg·mL-1)組、DTX(40μg·mL-1)組和L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)組的凋亡率沒有發(fā)生明顯變化。細(xì)胞周期的實驗結(jié)果顯示,與Control組相比,L-CNT(80μg·mL-1)組細(xì)胞周期沒有發(fā)生明顯變化。DTX(40μg·mL-1)組細(xì)胞發(fā)生明顯的G2/M期阻滯,G0/G1期細(xì)胞比例由70.23±4.5%降低至11.52±0.89%,G2/M期細(xì)胞由11.11±2.48%升高至54.91±2.38%,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與DTX(40μg·mL-1)組相比,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)組G0/G1期細(xì)胞比例由11.52±0.89%降低至3.98±0.42%,G2/M期細(xì)胞比例由54.91±2.38%升高至64.56±0.9%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
4、L-CNT能夠增高周期相關(guān)蛋白的表達與Control組相比,L-CNT(80μg·mL-1)組p21、p53、Bax和Bcl-2在蛋白水平的表達上均無明顯差異;DTX(40μg·mL-1)組細(xì)胞的周期相關(guān)蛋白p21和p53在蛋白的表達水平上有顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2無明顯變化。與DTX(40μg·mL-1)組相比,L-CNT(80μg·mL-1)+DTX(40μg·mL-1)組在周期相關(guān)蛋白p21和p53的表達上進一步升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達并未表現(xiàn)出明顯變化。
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