RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞的應(yīng)用及培養(yǎng)操作！
小楊 / 2024-02-05 09:36:03
一、背景
來源：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系來源于大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞，經(jīng)過多次傳代和篩選，形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的細(xì)胞系。
形態(tài)特征：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系呈多邊形或長條形，大小約為15-30微米，胞質(zhì)豐富，核大而圓，核仁明顯。
生長特性：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系生長迅速，傳代周期約為24-48小時(shí)，可在含有10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長。
特異性標(biāo)志物：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系表達(dá)多種特異性標(biāo)志物，如Ksp-cadherin、AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、NHE3、Na-K-ATPase等，可用于鑒定其視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞特性。
其他特性：RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系還具有一定的增殖能力，可用作研究視網(wǎng)膜疾病發(fā)生機(jī)制和藥物篩選的模型。
1)復(fù)蘇RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說明書為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。
下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應(yīng)用
檢測非諾貝特對(duì)AMD晚期視網(wǎng)膜纖維化的影響,并探討其作用的分子機(jī)制。
方法：新生血管性AMD模型采用極低密度脂蛋白受體(Vldlr)敲除小鼠,細(xì)胞模型選擇RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系。Vldlr-/-小鼠從2月齡開始分別喂食正常飼料或含非諾貝特飼料45天。RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系使用TGF-β2處理后分為溶劑組或非諾貝特酸組。用免疫印跡法和免疫熒光染色檢測纖維化標(biāo)記蛋白的表達(dá)來評(píng)估視網(wǎng)膜纖維化程度,包括波形蛋白,膠原蛋白,α-SMA和纖連蛋白。Masson染色檢測膠原沉積。免疫印跡法檢測TGF/Smad信號(hào)和Wnt信號(hào)激活情況。采用qRT-PCR、Western blot、免疫組化等方法檢測膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達(dá)。
結(jié)果：正常飼料組Vldlr-/-小鼠視杯中纖維化標(biāo)志物Collagen-1、α-SMA和Vimentin表達(dá)增加,而這些纖維化標(biāo)志物在非諾貝特飼料組的小鼠視杯中的表達(dá)明顯減少。在正常飼料組小鼠視杯中纖維化相關(guān)信號(hào)通路TGFβ/Smad信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白p-Smad2/3和n-p-β-catenin表達(dá)明顯升高,而這種升高在非諾貝特飼料組中被抑制。同時(shí),這兩條信號(hào)通路的下游基因CTGF的表達(dá)在正常飼料組中明顯升高,而非諾貝特飼料組中相對(duì)減少。TGFβ2處理可以使RMC-1大鼠視網(wǎng)膜MULLER細(xì)胞系中TGFβ/Smad信號(hào)通路和Wnt信號(hào)通路激活,這兩種信號(hào)通路的激活可以被非諾貝特酸抑制。同時(shí),TGFβ2可以使Muller細(xì)胞GFAP和CTGF表達(dá)增加,使用非諾貝特酸處理后GFAP和CTGF的表達(dá)被抑制。結(jié)論:非諾貝特抑制視網(wǎng)膜纖維化通過抑制TGFβ/Smad信號(hào)和Wnt信號(hào)和減少CTGF在新生血管性AMD的釋放。非諾貝特可能是一種潛在的治療AMD纖維化的藥物。
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