食品、醫(yī)藥、環(huán)境等領(lǐng)域中細(xì)菌的檢測(cè)非常普遍，具有重要的實(shí)用意義?；诳贵w的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)，因其速度快、特異性高而倍受青睞。近年來篩選的適配體已經(jīng)可以部分替代抗體用于細(xì)菌的分析檢測(cè)。目前篩選的適配體的Kd值在10-103 nmol/L，對(duì)不同細(xì)菌的檢出限因所用分析方法不同差別較大，其范圍在102 -106 CFU/mL之間。適配體的高特異性與高親和力的特點(diǎn)，使其可以很好地用于識(shí)別和捕獲靶標(biāo)細(xì)菌，基于此可設(shè)計(jì)多種細(xì)菌分析方法。目前用于細(xì)菌檢測(cè)的適配體方法有酶聯(lián)免疫、同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記、核酸染料、電化學(xué)傳感器、納米金顆粒、夾心法以及多適配體聯(lián)合等。
1、用適配體固定細(xì)菌的酶聯(lián)免疫分析
為了從S. aureus和E. coli O157:H7的混合菌液中檢測(cè)Sal. typhimurium，將5’端標(biāo)記生物素的RNA適配體固定在包被有親和素的96孔板上，再將細(xì)菌樣品在96孔板上室溫孵育1h，洗脫未結(jié)合的細(xì)菌后，加入該細(xì)菌特異性的抗體（一抗），再孵育、洗脫后，加入帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，再加入過氧化物酶底物溶液，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)425nm處的吸光值。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）原理，以適配體取代抗體固定抗原，可定量分析Sal. typhimurium，而不受其他細(xì)菌干擾。
2、放射性標(biāo)記適配體的液體閃爍計(jì)數(shù)法
使用帶有同位素標(biāo)記的適配體，則可以免除后續(xù)一抗、二抗的使用，直接進(jìn)行檢測(cè)。如在小牛腸磷酸酶作用下將RNA適配體5’端脫磷酸后，用[γ-32P］ATP（ 腺苷三磷酸）在T4多聚核苷酸激酶作用下磷酸化，得到5′端有32P標(biāo)記的適配體。將待測(cè)的S. typhimurium包被在96孔板上，與帶有32P標(biāo)記的RNA適配體在室溫下共同孵育1h，沖洗后用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定與靶標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的帶有同位素標(biāo)記的適配體，從而對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行定量，但是這種方法檢出限較高（106 CFU/mL）。
3、熒光標(biāo)記適配體的熒光光譜法
除了同位素標(biāo)記，也可以在適配體上修飾熒光基團(tuán)，用雙適配體夾心法進(jìn)行細(xì)菌分析。如將生物素修飾的適配體包被在96孔板上，與靶標(biāo)志賀氏菌在室溫下共同孵育1h，沖洗去除未結(jié)合的志賀氏菌后，加入帶有FAM熒光標(biāo)記的適配體在室溫下孵育1h，沖洗2次后測(cè)定熒光強(qiáng)度，檢出限可達(dá)50 CFU/mL，并且在 102 - 107 CFU/mL范圍內(nèi)都有良好的線性關(guān)系（R2＝0. 995 4）。
4、量子點(diǎn)標(biāo)記適配體的熒光光譜法
與使用熒光基團(tuán)標(biāo)記類似，在適配體上可以修飾量子點(diǎn)標(biāo)記。有人將帶有量子點(diǎn)標(biāo)記的適配體與靶細(xì)胞V. parahaemolyticus或S. typhimurium在37 ℃下共同孵育1h后，于3000 r/min下離心除去未結(jié)合的適配體。使用流式細(xì)胞儀對(duì)適配體-細(xì)菌復(fù)合物進(jìn)行分離計(jì)數(shù)。此外，用于針對(duì)兩種不同細(xì)菌的適配體上分別修飾了535nm和585nm兩種不同的量子點(diǎn)標(biāo)記，在流式細(xì)胞分選時(shí)可以同時(shí)檢測(cè)兩種細(xì)菌。相對(duì)于熒光基團(tuán)標(biāo)記，量子點(diǎn)熒光的發(fā)射波長(zhǎng)有更多的選擇，有利于多通道檢測(cè)，能夠?qū)崿F(xiàn)同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌。
5、上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒修飾適配體的熒光光譜法
上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒（upconversion nanoparticles，UCNP）利用抗斯托克斯發(fā)光（anti-Stokes）產(chǎn)生長(zhǎng)壽命熒光， 可以有效排除背景中細(xì)菌自發(fā)短壽命熒光的干擾，提高熒光信號(hào)的信噪比。使用多色UCNP分別標(biāo)記了針對(duì)S. aureus、V. parahaemolyticus和S. typhimurium的適配體，結(jié)合磁分離技術(shù)，在牛奶、對(duì)蝦樣品中同時(shí)檢測(cè)這3種致病菌，結(jié)果與傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法一致。
6、核酸染料輔助的適配體檢測(cè)方法
AccuBlue染料可以與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，但它單獨(dú)存在時(shí)或與ssDNA結(jié)合后產(chǎn)生的熒光較弱。將AccuBlue染料、適配體、與適配體互補(bǔ)的ssDNA結(jié)合使用，可以用于細(xì)菌的定量檢測(cè)。檢測(cè)方法分為兩種模式：（1）“signal on” 模式。將靶標(biāo)細(xì)菌與一定量的適配體共同孵育，形成靶標(biāo)-適配體復(fù)合物， 再加入適配體的互補(bǔ)序列與AccuBlue染料，體系中游離的適配體與互補(bǔ)序列形成dsDNA，結(jié)合染料后產(chǎn)生熒光，測(cè)定熒光強(qiáng)度的增加即可知游離的適配體濃度，進(jìn)而推算靶標(biāo)濃度。（2）“signal off” 模式。將適配體與其互補(bǔ)序列先形成dsDNA與AccuBlue染料產(chǎn)生熒光，再加入靶標(biāo)細(xì)菌與互補(bǔ)序列競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合適配體，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨著dsDNA的減少而降低。對(duì)V. parahaemolyticus和 S. typhimurium的檢出限分別達(dá)到35 CFU/mL和25 CFU/mL。由于是通過dsDNA間接測(cè)定適配體-靶標(biāo)復(fù)合物的濃度，因此針對(duì)不同樣品需要對(duì)核酸染料的用量進(jìn)行優(yōu)化，才能得到較顯著的熒光強(qiáng)度的變化，以保證檢測(cè)的特異性和靈敏度。
7、雙適配體夾心法
雙適配體夾心法（aptamer-based sandwich assay，ABSA）將適配體固定在96孔板上， 加入樣品孵育30min后，沖洗除去未結(jié)合的細(xì)菌，再加入帶有熒光修飾的適配體孵育，沖洗去除游離的適配體后測(cè)定熒光強(qiáng)度。Lee等使用L. monocytogenes的適配體對(duì)不同濃度的靶標(biāo)細(xì)菌的菌懸液進(jìn)行了測(cè)定，線性范圍為20-200 000 CFU/mL。
8、多適配體聯(lián)合的熒光成像法
細(xì)菌表面的蛋白質(zhì)、多糖以及鞭毛等都有可能成為適配體作用的靶標(biāo)。故對(duì)同一細(xì)菌有可能篩選到針對(duì)蛋白質(zhì)、多糖以及鞭毛等多種靶標(biāo)的不同適配體。將這些適配體聯(lián)合使用，有助于對(duì)全細(xì)胞的高特異性結(jié)合，可以顯著提高檢測(cè)靈敏度與特異性。如使用量子點(diǎn)標(biāo)記的3組不同適配體與E. coli結(jié)合，通過熒光成像發(fā)現(xiàn)這3組適配體可以同時(shí)非競(jìng)爭(zhēng)性地與靶標(biāo)E. coli結(jié)合。聯(lián)合使用這3組適配體相對(duì)單獨(dú)使用一種適配體，對(duì)E. coli的檢出限從103降低到102 CFU/mL。
9、適配體修飾的阻抗傳感器法
適配體也可以與電化學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用，從而提高靈敏度，進(jìn)一步降低檢出限。有人將篩選得到的鼠傷寒沙門氏菌的適配體用硫醇修飾后，通過自組裝結(jié)合到納米金修飾的碳電極上。通過測(cè)定適配體與靶標(biāo)結(jié)合前后阻抗的變化，即可對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行定量、定性分析。該方法可以從30 μL樣品中檢出最低18個(gè)細(xì)胞，且只檢測(cè)活的鼠傷寒沙門氏菌，對(duì)滅活的鼠傷寒沙門氏菌則沒有響應(yīng)。電化學(xué)的檢測(cè)方法有利于便攜檢測(cè)儀器的開發(fā)。
10、納米金顆粒的比色法
先用納米金顆粒吸附鼠傷寒沙門氏菌或大腸埃希氏菌的適配體。當(dāng)這些適配體捕獲靶標(biāo)后，納米金顆粒會(huì)聚集沉淀，其溶液顏色由紅變紫，通過測(cè)定吸光度的變化，可對(duì)靶標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行定量。納米金顆粒對(duì)非靶標(biāo)的其他種屬的細(xì)菌如S. paratyphi A或金黃色葡萄球菌的吸附較少，故溶液顏色沒有變化。該方法的檢測(cè)特異性較好，但檢出限較高（105CFU/mL）。