酵母人工染色體（yeast artificial chromosome，YAC）
中國微生物菌種查詢網(wǎng) / 2019-01-25 08:39:40
一、酵母人工染色體的概念
酵母人工染色體（Yeast artificial chromosomes，YAC）是一種穿梭克隆載體，可以克隆長達(dá)400Kb的DNA片段，含有質(zhì)?？寺≥d體所必備的第一受體大腸桿菌的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)(ori)，還含有第二受體酵母天然染色體所必需的功能元件，包括兩個端粒、一個著絲點(diǎn)和一個DNA復(fù)制起始位點(diǎn)。
YAC載體在第一受體大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)可以按質(zhì)粒復(fù)制形式進(jìn)行高拷貝復(fù)制。將載體在體外與目的DNA片段重組后，轉(zhuǎn)化第二受體酵母細(xì)胞，可在酵母細(xì)胞內(nèi)按染色體DNA復(fù)制的形式進(jìn)行復(fù)制。篩選第一受體的克隆子，一般采用抗菌素抗性選擇標(biāo)記；而篩選第二受體的克隆子，常用與受體互補(bǔ)的營養(yǎng)缺陷型。
二、YAC載體的核心組成元件
YAC載體的復(fù)制元件是其核心組成元件，其在酵母中復(fù)制的必需元件包括復(fù)制起點(diǎn)序列，即自主復(fù)制序列（autonomously replicating sequence，ARS）、用于有絲分裂和減數(shù)分裂功能的著絲粒（centromere，CEN）和兩個端粒（TEL）。
YAC載體為能夠滿足自主復(fù)制、染色體在子代細(xì)胞間的分離及保持染色體穩(wěn)定的需要，必須含有以下元件：
（1）端粒重復(fù)序列（telomeric repeat，TEL）：定位于染色體末端的一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。
（2）著絲粒（centromere，CEN）：有絲分裂過程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個細(xì)胞內(nèi)只有一個人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。
（3）自主復(fù)制序列（autonomously replication sequences，ARS）：一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號。
（4）標(biāo)記基因。YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突變抑制基因sup4。與YAC載體配套工作的宿主酵母菌（如AB1380）的胸腺嘧啶合成基因帶有一個赭石突變ade 2-1。帶有這個突變的酵母菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上形成紅色菌落，當(dāng)帶有赭石突變抑制基因sup4的載體存在于細(xì)胞中時，可抑制ade 2-1基因的突變效應(yīng)，形成正常的白色菌落。利用這一菌落顏色轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，可用于篩選載體中含有外源DNA片段插入的重組子。
三、YAC載體的工作原理
YAC 在結(jié)構(gòu)上能模擬酵母染色體的線狀DNA分子。將大片段的基因組DNA連接到Y(jié)AC載體的兩個“臂”上，然后將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入酵母菌，這樣就構(gòu)成了重組的YAC。每一條臂分子中都攜帶一個選擇標(biāo)記以及按適當(dāng)方向排列的起端粒作用的DNA序列。另外，其中一條臂上還攜帶著絲粒DNA序列以及復(fù)制子序列。因此在重組的YAC中，外源基因組DNA片段的一側(cè)為著絲粒、復(fù)制子及選擇標(biāo)記，另一側(cè)為第二種選擇標(biāo)記。通過在選擇性瓊脂平板上生長的菌落可鑒定出已轉(zhuǎn)化并穩(wěn)定保持人工染色體的酵母轉(zhuǎn)化子。
在 YAC載體中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色體是線狀的，因此其在工作狀態(tài)也是線狀的。但是，為了方便制備YAC載體，YAC載體以環(huán)狀的方式存在，并增加了普通大腸桿菌質(zhì)粒載體的復(fù)制元件和選擇標(biāo)記，以便保存和增殖。
YAC載體主要是用來構(gòu)建大片段DNA文庫，特別用來構(gòu)建高等真核生物的基因組文庫，并不用作常規(guī)的基因克隆。下圖是以pYAC4為例如，當(dāng)用BamHI切割成線狀后，就形成了一個微型酵母染色體，包含染色體復(fù)制的必要順式元件，如自主復(fù)制序列、著絲粒和位于兩端的端粒。對于BamHI切割后形成的微型酵母染色體，當(dāng)用EcoRI或SmaI切割抑制基因sup4內(nèi)部的位點(diǎn)后形成染色體的兩條臂，與外源大片段DNA在該切點(diǎn)相連就形成一個大型人工酵母染色體，通過轉(zhuǎn)化進(jìn)入到酵母菌后可象染色體一樣復(fù)制，并隨細(xì)胞分裂分配到子細(xì)胞中去，達(dá)到克隆大片段DNA的目的。
裝載了外源DNA片段的重組子導(dǎo)致抑制基因sup4插入失活，從而形成紅色菌落；而載體自身連接后轉(zhuǎn)入到酵母細(xì)胞后形成白色菌落。這些紅色的裝載了不同外源DNA片段的重組酵母菌菌落的群體就構(gòu)成了YAC文庫。
四、YAC載體的優(yōu)缺點(diǎn)
YAC載體雖然功能強(qiáng)大，但有一些缺點(diǎn)，主要表現(xiàn)在3 個方面：
（1）在YAC載體的插入片段會出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）現(xiàn)象。
（2）容易形成嵌合體。嵌合就是在單個YAC中的插入片段由2個或多個的獨(dú)立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5-50%。
（3）YAC染色體與宿主細(xì)胞的染色體大小相近，影響了YAC載體的廣泛應(yīng)用。YAC染色體一旦進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞，由于其大小與內(nèi)源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來，不利于進(jìn)一步分析。
但是YAC載體也具有一些突出的優(yōu)點(diǎn)：
（1）容量大。YAC文庫裝載的DNA片段的大小一般可達(dá)200-500kb，有的可達(dá)1Mb以上，甚至達(dá)到2Mb。大片段的DNA序列插入更有可能包含完整的功能基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。
（2）穩(wěn)定性好。酵母細(xì)胞比大腸桿菌對不穩(wěn)定的、重復(fù)的和極端的DNA有更強(qiáng)的容忍性。
（3）功能基因組研究的有力工具。YAC在功能基因和基因組研究中是一個非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多數(shù)是多外顯子結(jié)構(gòu)并且有長長的內(nèi)含子，大型基因組片段可通過YAC載體轉(zhuǎn)移到動物或動物細(xì)胞系中，進(jìn)行功能研究。