百歐博偉生物：菌種的保藏是無(wú)菌檢驗(yàn)、微生物限度檢驗(yàn)工作中的一項(xiàng)重要內(nèi)容。用人工方法低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養(yǎng)等方法控制微生物的代謝，使細(xì)胞基本上處于休眠狀態(tài)，繁殖受到抑制但仍保持菌種原有的各種生物學(xué)特性，以達(dá)到保種的目的。菌種保藏的關(guān)鍵是不變異、不污染、不死亡。
一、菌種保藏步驟
1、挑選特征典型的純菌菌落。其方法是用接種環(huán)挑取少許菌苔，接種至2ml營(yíng)養(yǎng)肉湯或0.9%氯化鈉溶液中制成菌液，再取一環(huán)菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后可見(jiàn)單個(gè)菌落生長(zhǎng)。
2、凡能產(chǎn)生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢進(jìn)行保種。孢子和芽胞的代謝作用較弱，但對(duì)惡劣環(huán)境有很強(qiáng)的抵抗。在傳代前，將菌液管放入80℃水浴中作用30分鐘，殺死雜菌繁殖體后用芽孢傳代。
3、定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退，檢查項(xiàng)目包括菌落形態(tài)、染色、鏡檢、生化特性及血清學(xué)檢查。
4、選擇適宜的培養(yǎng)基及保藏方法。
二、常用菌種的保藏方法
1、普通瓊脂斜面
用于常用菌株的傳代。在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。接種培養(yǎng)后，將菌種管用硅膠塞塞緊，置4℃冰箱保存，每隔2～3個(gè)月傳種1次。銅綠假單孢菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，其菌種須放25℃培養(yǎng)箱內(nèi)保存。
2、半固體瓊脂
用于常用菌株的傳代。在營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)按0.5%加入瓊脂粉配制而成。穿刺接種培養(yǎng)后，置4℃冰箱保存，6個(gè)月傳種1次。如在培養(yǎng)管內(nèi)加少量無(wú)菌液體石蠟隔絕空氣，減少水分蒸發(fā)，可延長(zhǎng)菌種的保藏期。
3、真菌瓊脂斜面
用于真菌的傳代。在真菌培養(yǎng)基內(nèi)按1.3%加入瓊脂粉配制而成。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。
4、沙氏瓊脂斜面
用于真菌的傳代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，瓊脂粉13g，加蒸餾水1000mL，待上述成分溶化后，搖勻分裝，115℃滅菌20分鐘，趁熱擺成斜面。劃線接種后，20～25℃培養(yǎng)24小時(shí)，置4℃冰箱保存，3～6個(gè)月傳種1次。
5、40％甘油水
用于細(xì)菌的傳代。配制方法：甘油40mL加水至100mL即成。分裝至試管內(nèi)，每支2mL左右，121℃滅菌20分鐘備用。接種細(xì)菌后直接放4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。
6、需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基
用于生孢梭菌的傳代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1mL至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基15mL內(nèi)，30～35℃培養(yǎng)18～24h，置4℃冰箱內(nèi)保存3～6個(gè)月傳種1次。
7、皰肉培養(yǎng)基
用于破傷風(fēng)梭菌的傳代。取破傷風(fēng)梭菌CMCCB64067菌液0.1mL接種于皰肉培養(yǎng)基內(nèi)，36℃±1℃厭氧培養(yǎng)3～4天，置4℃冰箱保存，6～12個(gè)月傳代1次。
8、液氮超低溫保藏法
適用于各類微生物的保藏。液氮溫度可達(dá)-196℃，此時(shí)菌種的新陳代謝活動(dòng)已停止，但不會(huì)死亡。在配制好的菌液內(nèi)加10％甘油作為保護(hù)劑，分裝于安瓿中，置液氮罐內(nèi)可保存10年之久。
9、冷凍真空干燥保藏法
本法廣泛適用于各類微生物的保藏，包括病毒和噬菌體。將菌液混于有保護(hù)作用的介質(zhì)內(nèi)，分裝于滅菌菌種管內(nèi)，速凍后抽真空，使菌液很快變?yōu)槭杷傻母稍锞?，最后在真空狀態(tài)下密封管口，菌種保存期最長(zhǎng)可達(dá)20年以上。
10、常用菌種的保藏條件及傳種時(shí)間，見(jiàn)表1。
三、菌種檢查與復(fù)壯
菌種在傳代保藏過(guò)程中，易發(fā)生衰退、變異、污染和死亡，因此必須定期檢查。將菌種接種至液體培養(yǎng)基內(nèi)使之復(fù)活，重新分離，純化形成單個(gè)菌落，再作菌種鑒定，包括菌落形態(tài)、顏色，染色性、鏡下觀察菌體形態(tài)等，必要時(shí)可做生化試驗(yàn)及血清學(xué)反應(yīng)。
菌種經(jīng)人工傳代保藏過(guò)程中，由于自發(fā)突變而引起特性變?nèi)趸蛳鶠榫N衰退。使衰退的菌種重新恢復(fù)原來(lái)的優(yōu)良特性，稱為菌種復(fù)壯。常用方法有：
①分離純化：將菌種接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)，取菌液在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上分區(qū)劃線，培養(yǎng)后挑取典型單個(gè)菌落。
②宿主復(fù)壯：將退化菌種接種到相應(yīng)昆蟲(chóng)或動(dòng)植物宿主體內(nèi)，傳種數(shù)代可恢復(fù)其原有的特性與毒力。
③抗逆復(fù)壯：通過(guò)極端的逆境處理使那些退化的細(xì)菌死亡，選育健壯的傳代保種。
四、實(shí)驗(yàn)菌種的管理
菌種應(yīng)放入專用冰箱，實(shí)行雙人、雙鎖保管。菌種應(yīng)有購(gòu)入記錄，傳代記錄，領(lǐng)用記錄和銷毀記錄。菌種應(yīng)定期檢查、分離、純化，以防菌種變異及衰退。菌種傳代應(yīng)不超過(guò)五代。
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