菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)24～48 小時(shí)，上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)小于100CFU（菌落形成單位）的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng) 物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)5～7 天，加入3～5ml 含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無(wú)菌試管內(nèi)，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml 含孢子數(shù)小于100CFU 的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2 小時(shí)內(nèi)使用，若保存在2～8℃可在24 小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃，在驗(yàn)證過(guò)的貯存期內(nèi)使用。
培養(yǎng)基接種 取每管裝量為12ml 的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基7 支，分別接種小于100CFU 的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌各2 支，另1 支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)3 天；取每管裝量為9ml 的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基7 支,分別接種小于100CFU 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接種作為空白對(duì)照，培養(yǎng)5 天。逐日觀察結(jié)果。
結(jié)果判定 空白對(duì)照管應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)，若加菌的培養(yǎng)基管均生長(zhǎng)良好，判該培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。
稀釋液、沖洗液及其制備方法
稀釋液、沖洗液配制后應(yīng)采用驗(yàn)證合格的滅菌程序滅菌。
1.0.1%蛋白胨水溶液 取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，調(diào)節(jié)pH 值至7.1±0.2，分裝，滅菌。
2．pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液 取磷酸二氫鉀3.56g，磷酸氫二鈉7.23g，氯化鈉4.30g，蛋白胨1.0g，加水1000ml，微溫溶解，濾清，分裝，滅菌。
3. 根據(jù)供試品的特性，可選用其他經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液(如0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液)。
如需要，可在上述稀釋液或沖洗液的滅菌前或滅菌后加入表面活性劑或中和劑等。
方法適用性試驗(yàn)
當(dāng)進(jìn)行產(chǎn)品無(wú)菌檢查法時(shí)，應(yīng)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，以確認(rèn)所采用的方法適合于該產(chǎn)品的無(wú)菌檢查。若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
方法適用性試驗(yàn)按“供試品的無(wú)菌檢查”的規(guī)定及下列要求進(jìn)行操作。對(duì)每一試驗(yàn)菌應(yīng)逐一進(jìn)行方法確認(rèn)。
菌種及菌液制備 除大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培養(yǎng)基靈敏度檢查。大腸埃希菌的菌液制備同金黃色葡萄球菌。
薄膜過(guò)濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量按薄膜過(guò)濾法過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入小于100CFU 的試驗(yàn)菌，過(guò)濾。加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一裝有同體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 天，各試驗(yàn)菌同法操作。
直接接種法 取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基6 管，分別接入小于100CFU 的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌各2 管，取符合直接接種法培養(yǎng)基用量要求的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基6 管，分別接入小于100CFU 的枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 管。其中1 管接入每支培養(yǎng)基規(guī)定的供試品接種量，另1 管作為對(duì)照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5 天。
結(jié)果判斷 與對(duì)照管比較，如含供試品各容器中的試驗(yàn)菌均生長(zhǎng)良好，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下無(wú)抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不計(jì)，照此檢查方法和檢查條件進(jìn)行供試品的無(wú)菌檢查。 如含供試品的任一容器中的試驗(yàn)菌生長(zhǎng)微弱、緩慢或不生長(zhǎng)，則說(shuō)明供試品的該檢驗(yàn)量在該檢驗(yàn)條件下有抑菌作用，應(yīng)采用增加沖洗量、增加培養(yǎng)基的用量、使用中和劑或滅活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。
方法適用性試驗(yàn)也可與供試品的無(wú)菌檢查同時(shí)進(jìn)行。
供試品的無(wú)菌檢查
無(wú)菌檢查法包括薄膜過(guò)濾法和直接接種法。只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過(guò)濾法。供試品無(wú)菌檢查所采用的檢查方法和檢驗(yàn)條件應(yīng)與方法適用性試驗(yàn)確認(rèn)的方法相同。
無(wú)菌試驗(yàn)過(guò)程中，若需使用表面活性劑、滅活劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對(duì)微生物無(wú)毒性。
檢驗(yàn)數(shù)量 檢驗(yàn)數(shù)量是指一次試驗(yàn)所用供試品最小包裝容器的數(shù)量。除另有規(guī)定外，出廠產(chǎn)品按表1 規(guī)定；上市產(chǎn)品監(jiān)督檢驗(yàn)按表2 規(guī)定。表1、表2中最少檢驗(yàn)數(shù)量不包括陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的供試品用量。
檢驗(yàn)量 是指供試品每個(gè)最小包裝接種至每份培養(yǎng)基的最小量（g 或ml）。除另有規(guī)定外,供試品檢驗(yàn)量按表3 規(guī)定。若每支（瓶）供試品的裝量按規(guī)定足夠接種兩種培養(yǎng)基，則應(yīng)分別接種硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基。采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，只要供試品特性允許，應(yīng)將所有容器內(nèi)的全部?jī)?nèi)容物過(guò)濾。
陽(yáng)性對(duì)照 應(yīng)根據(jù)供試品特性選擇陽(yáng)性對(duì)照菌：無(wú)抑菌作用及抗革蘭陽(yáng)性菌為主的供試品，以金黃色葡萄球菌為對(duì)照菌；抗革蘭陰性菌為主的供試品以大腸埃希菌為對(duì)照菌；抗厭氧菌的供試品，以生孢梭菌為對(duì)照菌；抗真菌的供試品，以白色念珠菌為對(duì)照菌。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)的菌液制備同方法適用性試驗(yàn)，加菌量小于100CFU，供試品用量同供試品無(wú)菌檢查時(shí)每份培養(yǎng)基接種的樣品量。陽(yáng)性對(duì)照管培養(yǎng)48～72 小時(shí)應(yīng)生長(zhǎng)良好。
陰性對(duì)照 供試品無(wú)菌檢查時(shí)，應(yīng)取相應(yīng)溶劑和稀釋液、沖洗液同法操作，作為陰性對(duì)照。陰性對(duì)照不得有菌生長(zhǎng)。