一、背景
白假絲酵母是一種人類常見條件致病真菌，通常存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道，在人體抵抗力下降時(shí)會(huì)引起感染甚至危及生命。近年來，深部真菌感染日益成為醫(yī)院內(nèi)主要感染，其中白假絲酵母成為假絲酵母感染中最常見的病原。白假絲酵母是一種具有多種形態(tài)的真菌，形態(tài)有厚膜孢子、酵母、假菌絲、菌絲等。其中菌絲相與酵母相的轉(zhuǎn)化被認(rèn)為是影響致病的重要因素。已有許多研究證實(shí)，不產(chǎn)生菌絲相的基因缺陷型白假絲酵母在動(dòng)物模型中致病性降低，而酵母相的白假絲酵母則有助于播散性感染。
生物被膜是由酵母細(xì)胞、菌絲和細(xì)胞外多聚基質(zhì) 3部分組成 的一種結(jié)構(gòu)群體。在白假絲酵母，生物被膜的形成會(huì)使其對(duì)一些臨床常用抗真菌感染藥物產(chǎn)生高度耐藥性。因此，白假酵母的形態(tài)變化對(duì)其在宿主環(huán)境下的生存、致病及耐藥性有很大意義。在白假絲酵母形態(tài)轉(zhuǎn)化過程中，能發(fā)向細(xì)胞外釋放一些特定信號(hào)分子，調(diào)節(jié)微生物的密度變化，這類小分子物質(zhì)稱為群體感應(yīng)分子(quorum sensingmolecule)。
目前白假絲酵母中已確定的群體感應(yīng)分子有法尼醇 (farneso1)、酪醇 (tyroso1)和麝油酸 (farnesoic acid)。此外，不同形態(tài)的白假酵母對(duì)氨基酸的攝取不完全相同，甚至存在很大差異。在宿主中生存時(shí)，受大量外界環(huán)境的影響，如宿主的免疫系統(tǒng)、滲透性、溫度、pH 值、氧化水平、養(yǎng)分有效性、氧化還原態(tài)等，白假絲酵母會(huì)發(fā)生很大變化，承受極大的外界壓力。處于逆境中的白假絲酵會(huì)于數(shù)分鐘內(nèi)在基和代謝水平上作出適 當(dāng)反應(yīng)，最終使細(xì)胞獲得對(duì)逆境的抗性。
這些對(duì)外界 環(huán)境產(chǎn)生的應(yīng)激性使白假絲酵母快速適應(yīng)外界環(huán)境，對(duì)其耐藥性的產(chǎn)生起一定作用。當(dāng)處于對(duì)數(shù)生長期 的白假絲酵 面臨高溫、NaCI、H2O2、CuSO4、高濃度乙醇、弱有機(jī)酸 (山梨酸酯 和苯甲酸)等脅迫時(shí)，會(huì)不同程度引起細(xì)胞內(nèi)海藻糖 (trehalose)濃度上升；受高滲和檸檬酸影響時(shí)會(huì)積累大量甘油 (glycero1)；受高溫和氧化應(yīng)激時(shí)會(huì)生成大量阿拉伯糖醇 (D—arabito1)，這些化合物都對(duì)白假絲酵母的生物大分子有一定的保護(hù)作用。
二、活性代謝物
1、胞外活性代謝物
白假絲酵母在生長過程中，會(huì)產(chǎn)生一些有機(jī)化合物，分泌至胞外，其中部分為群體感應(yīng)分子。對(duì)這類化合物的提取和分離主要是收集培養(yǎng)上清液，再對(duì)培養(yǎng)上清液進(jìn)行一系列處理，然后供分析。
1）法尼醇
法尼醇是第 1個(gè)被發(fā)現(xiàn)的白假絲酵母生長過程中分泌的胞外群體感應(yīng)分子。有文獻(xiàn)報(bào)道，它能影響白假絲酵母的雙相性和被膜生長，抑制芽管形成，抑制酵母向菌絲轉(zhuǎn)，抑制被膜形成；同時(shí)也會(huì)增強(qiáng)由 H2O 等引起的氧化性應(yīng)激下白假絲酵的存活率，是目前發(fā)現(xiàn)的白假絲酵母中作用最強(qiáng)、研究最多的群體感應(yīng)分子。
法尼醇是揮發(fā)性的萜類化合物，因此常用氣相色譜-質(zhì)譜 (GC．MS)進(jìn)行檢測(cè)。將收集的含法尼醇的培養(yǎng)上清液進(jìn)行過濾后直接進(jìn)樣，或采用乙酸乙酯液液萃取，進(jìn)一步提純其中脂溶性有效成分， 并分別采用 RP-HPLC-MS)、衍化 GCMS、薄層譜法對(duì)法尼醇進(jìn)行鑒定。
2）麝油酸
麝油酸能抑制酵母向菌絲轉(zhuǎn)化。與法尼醇相比，麝油酸的分泌有局限性，僅能在特定菌株中表達(dá)，且作用相對(duì)較弱，僅為法尼醇的 3％。高濃度麝油酸可抑制白假絲酵母菌絲生長，但不抑制酵母生長。相對(duì)法尼醇，麝油酸酵母向菌絲形 態(tài)轉(zhuǎn)化的選擇性 更強(qiáng)將培養(yǎng)上清液凍干，用甲醇復(fù)溶，離心后取上清液；再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇溶液揮干，用己烷復(fù)溶；正相高效液相色譜 (NP—HPLC) 進(jìn)行分離，收集流出的有效成分；揮干，用 0．1ml的 90％乙腈復(fù)溶，RP—HPLC進(jìn)行梯度洗脫，獲得麝油酸單體；并用 GC．MS和核磁共振波譜 (NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
3）酪醇
酪醇的分泌會(huì)促進(jìn)菌絲生長，從而縮短轉(zhuǎn)化時(shí)間。在利于菌絲生長的條件下，酪醇還會(huì)縮短細(xì)胞發(fā)展成芽管的時(shí)間，促進(jìn)芽管形成，該作用在被膜生長的早期和中期最為顯著。固相萃取、富集白假絲酵母培養(yǎng)液后，用 RP．HPLC純化、制備酪醇，并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行 NMR鑒定。
4）苯乙醇和色醇
有報(bào)道，苯乙醇和色醇在白假絲酵母中起抑制菌絲形成和細(xì)胞生長的作用，但這 2個(gè)化合物對(duì)白假絲酵母形態(tài)的影響機(jī)制尚不明確，但要達(dá)到 500 mol／L才能抑制絲化現(xiàn)象，所以其在正常濃度范圍內(nèi)抑制菌絲的作用有待進(jìn)一步研究。
5）MARS
在白假絲酵母研究中發(fā)現(xiàn)了一種物質(zhì)并命名為 MARS，它能耐高溫，70℃下 放置 30min還能保持穩(wěn)定，但在分離 48h后或 pH 超出 4～9．5時(shí)，就會(huì)失去抑制絲化的活性。不僅白 假絲酵母可分泌 MARS，熱帶假絲酵母也可分泌。將含 MARS的組分用吡啶或乙醚萃取后，經(jīng)RP—HPLC進(jìn)一步純化、收集。經(jīng)鑒定， MARS有 1個(gè)含氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，能抑制假絲酵母中氨基酸攝取。但 MARS分子結(jié)構(gòu)及其在調(diào)節(jié)白假絲酵母形態(tài)轉(zhuǎn)化中的作用仍需深入研究。
2、胞內(nèi)代謝物
白假絲酵母代謝產(chǎn)生用于合成蛋白質(zhì)、核酸、類脂和多糖等的一些小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、機(jī)酸和單糖衍生物等，與微生物細(xì)胞內(nèi)生物合成息息相關(guān)。要對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行分析，首先要進(jìn)行細(xì)胞破碎，目前主要方法有化學(xué)試劑裂解、低滲溶液脹破、反復(fù)凍融和機(jī)械性方法，將細(xì)胞破碎后才能對(duì)胞內(nèi)代謝物進(jìn)行下一步研究。
1）氨基酸類
氨基酸對(duì)白假絲酵母形態(tài)轉(zhuǎn)化起一定作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，血清和氨基酸都是已知的能誘導(dǎo)白假絲酵母發(fā)生形態(tài)轉(zhuǎn)化的物質(zhì)，但其分子機(jī)制仍不明確。氨基酸種類或數(shù)量不足也會(huì)刺激白假絲酵母的形態(tài)變化。
白假絲酵母的 2種形態(tài)對(duì)各種氨基酸的攝取需求也不完全相同，甚至存在很大差異。早期，對(duì)白假絲酵母中氨基酸的分析方法主要是往培養(yǎng)基中加入放射性核素標(biāo)記的氨基酸，待菌體收集、洗滌 完全后，吹干，轉(zhuǎn)移到閃爍瓶中，用液體閃爍計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。近年來，色譜技術(shù)廣泛運(yùn)用于氨基酸的分析。
2）海藻糖
海藻糖是化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的非還原性二糖，南 2個(gè)吡喃分子通過糖苷鍵連接而成。它是細(xì)胞中的一種應(yīng)激代謝物，當(dāng)細(xì)胞處于長時(shí)間饑餓、高滲、熱激以及孢子萌發(fā)時(shí)，海藻糖含會(huì)發(fā)生顯著變化，恢復(fù)正常環(huán)境后又迅速降解。因此，海藻糖含量的變化從某種程度上反映了機(jī)體對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)，在對(duì)不同脅迫應(yīng)答中，海藻糖的積累被認(rèn)為起關(guān)鍵作用。
3）甘油和阿拉伯糖醇
白假絲酵母在生長過程會(huì)積累大量甘油和 D-阿拉伯糖醇，造成哺乳動(dòng)物感染。在培養(yǎng) 6h后能產(chǎn)生最大量的甘油，在 12h產(chǎn)生最大量的 D-阿拉伯糖醇和核糖醇。這些多元醇的釋放與胞外環(huán)境有關(guān)。將細(xì)胞處理后，用甲基硅醚衍生化，以甲基甘露苷作為內(nèi)標(biāo)，通過 GC定量測(cè)定 D-阿拉伯糖醇。
采用熱乙醇將細(xì)胞破碎，過濾取上清液，有效成分經(jīng)甲基硅烷衍生化后進(jìn)行 GC分析。該法可同時(shí)測(cè)定甘油、核醇、阿拉伯糖醇和海藻糖，但未能將核糖醇和阿拉伯糖醇分開，且甘油出峰時(shí)間較靠前，可能被衍生化試劑的峰掩蓋。
三、致病性
白念珠菌是一種機(jī)會(huì)性致病真菌，通常存在于人的皮膚、口腔、上呼吸道、腸道和陰道黏膜，當(dāng)機(jī)體菌群失調(diào)或抵抗力降低時(shí)，可引起各種念珠菌病，甚至血流感染。
四、基因分型方法
分子分型是分析機(jī)會(huì)性病真菌種群結(jié)構(gòu)和流行性的重要方法，能有效鑒定 社區(qū)或醫(yī)院內(nèi)感染、追蹤傳染源、分析暴發(fā)流行、研究種群動(dòng)力學(xué)、區(qū)分多重感染和評(píng)估微進(jìn)化。
白念珠菌基因分型的方法主要有：脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pulsedfieldgelelectrophoresis，PFGE)、限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)分析、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA (random amplifiedpolymorphicDNA，RAPD)分析、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)分析、重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng) (polymerase chain yeaction，PCR)、 DNA指紋分析、基因芯片 (DNA 芯片)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer，ITS)核 酸序列定、微衛(wèi)星多態(tài)性分析、單核苷酸多態(tài) 性(singlenucleotidepolymorphismS，NP)析、單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (singlestrandconformation polymorphism，SSCP)分析與異源雙鏈 (heteroduple)分析、多位點(diǎn)序列分型 (multilocussequencetyping，MLST)等。
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