一、背景
人非小細胞肺癌細胞來源于58歲的白人男性肺癌組織，由D.J.Giard等人建立于1972年。M.Lieber發(fā)現(xiàn)A549可以通過胞苷二磷酸膽堿途徑合成高比例的不飽和脂肪酸卵磷脂。
二、人非小細胞肺癌細胞復(fù)蘇、傳代及凍存流程參考：
1、人非小細胞肺癌細胞復(fù)蘇
1）配制完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基+胎牛血清+雙抗（特殊培養(yǎng)基特殊配置）；
2）人非小細胞肺癌細胞復(fù)蘇：取5ml完全培養(yǎng)基于15ml離心管中，37℃水浴鍋預(yù)熱，從液氮管（或者-80度冰箱）中快速取出凍存的細胞，放入37℃水浴鍋中，搖晃使快速化凍（1min左右），然后將化凍的細胞和預(yù)熱的培養(yǎng)基，移入超凈工作臺中，化凍的細胞加入到含預(yù)熱培養(yǎng)基的15ml離心管中，1000rpm離心5min；
3）吸棄上清，得到細胞沉淀，用2ml完全培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，加入到T25培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入37℃，5%CO2飽和適度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)皿復(fù)蘇效果更好）；
4）24h后，觀察細胞貼壁情況（未貼壁的即為死細胞--針對貼壁細胞），吸棄舊培養(yǎng)基，加入新鮮的預(yù)熱（室溫或37℃）的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
2、人非小細胞肺癌細胞傳代
1）待細胞生長到80%-90%匯合度時，吸棄舊的培養(yǎng)基，加入1ml無菌PBS潤洗一次，以去除殘余的培養(yǎng)基及血清（血清含有胰酶的抑制因子），然后加入1ml 0.25%胰酶，37℃培養(yǎng)箱中消化（1~2min左右，不同細胞消化時間不同），取出細胞，鏡下觀察細胞至細胞皺縮變圓；
2）加入1ml完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS）終止消化，輕輕拍打，使細胞脫落下來成單個細胞懸液，收集細胞于15ml無菌離心管中，1000rpm，離心5min；
3）收集細胞沉淀，完全培養(yǎng)基重懸，一分為二（可根據(jù)細胞生長速度調(diào)整比例），分別加入到2個新的培養(yǎng)瓶中，做好標(biāo)記，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3、人非小細胞肺癌細胞凍存
1）按照細胞傳代方法，在超凈工作臺內(nèi)消化收集細胞沉淀，取少量細胞用于計數(shù)；
2）用預(yù)冷的1ml凍存液（90%完全培養(yǎng)基+10%DMSO）或者無血清細胞凍存液重懸細胞，加入到1.2ml凍存管中，密度為1*106個/ml。
3）放入程序凍存盒，-80℃過夜后，轉(zhuǎn)入液氮長期保存。
三、應(yīng)用
人非小細胞肺癌細胞可以用于蜂毒肽對人非小細胞肺癌A549細胞增殖的影響和機制研究：
探討蜂毒肽對人非小細胞肺癌A549細胞增殖的影響及其作用機制。
方法：
(1)分別用0 ng/ul、2.5 ng/ul、5 ng/ul、10 ng/ul、20 ng/ul的蜂毒肽處理人非小細胞肺癌A549細胞,CCK8法檢測不同濃度蜂毒肽對人非小細胞肺癌A549細胞的增殖活性的影響,并計算IC50;
(2)以0 ng/ul(對照組)和3 ng/ul(MEL組)的蜂毒肽分別處理人非小細胞肺癌A549細胞,細胞克隆形成實驗觀測蜂毒肽對人非小細胞肺癌A549細胞的克隆形成能力的影響;
(3)構(gòu)建人非小細胞肺癌A549細胞裸鼠皮下移植瘤模型,以瘤內(nèi)注射100 ul蜂毒肽溶液(劑量5 mg/kg/只)的裸鼠為實驗組,瘤內(nèi)注射等體積生理鹽水的裸鼠為對照組,檢測兩組裸鼠皮下移植瘤的體積和重量變化;
(4)以0 ng/ul(對照組)和3 ng/ul(MEL組)的蜂毒肽分別處理非小細胞肺癌A549細胞,基于二代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序,分析蜂毒肽對人非小細胞肺癌A549細胞基因表達和信號通路的影響。
結(jié)果：
(1)蜂毒肽能抑制人非小細胞肺癌A549細胞的增殖,在0～10 ng/ul濃度區(qū)間內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系,在10～20 ng/ul濃度區(qū)間抑制作用顯著,當(dāng)濃度達到20 ng/ul時,非小細胞肺癌A549細胞基本全部死亡;
(2)3 ng/ul蜂毒肽能明顯抑制人非小細胞肺癌A549細胞的克隆形成(P<0.05);
(3)瘤內(nèi)注射100 ul蜂毒肽溶液(劑量5 mg/kg/只)能明顯抑制人非小細胞肺癌A549細胞裸鼠皮下移植瘤的生長,給藥后14天抑制率為41.4%(P<0.001);
(4)轉(zhuǎn)錄組測序后共發(fā)現(xiàn)差異表達基因1217個,基因功能差異主要富集在細胞遷移的正向調(diào)節(jié)和血管生成的生物過程中,磷脂酰肌激酶3/蛋白激酶B(PI3K-AKT)信號通路中差異基因表達顯著。
結(jié)論：蜂毒肽可能通過調(diào)控PI3K-AKT信號通路中相關(guān)基因的表達,抑制人非小細胞肺癌A549細胞的增殖。
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