一、背景
大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞由H Metzger和C Isersky由一名白血病患者的外周血中分離并建立，細(xì)胞表現(xiàn)出嗜堿性粒多種細(xì)胞特性，例如細(xì)胞表面帶有IgE受體.但在IgE介導(dǎo)的反應(yīng)中，該細(xì)胞并不釋放組織胺。
二、大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞培養(yǎng)步驟
1、復(fù)蘇大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加4-6mL完全培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2、大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄上清液，補(bǔ)加1-2ml培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或瓶中。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基新皿中或者瓶中。
3、大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞凍存：
（1）細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)瓶的80%面積時(shí)，棄25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用PBS清洗細(xì)胞一次；
（2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后加入完全培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；
（3）用適量的凍存液重懸細(xì)胞，并放置于凍存管中；
（4）先將細(xì)胞凍存管放置于-20℃1.5h，然后將其移入-80℃
三、應(yīng)用
大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞可以用于小鼠全身類過敏試驗(yàn)方法與小鼠（耳廓藍(lán)染）類過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)方法的比較研究：
為了系統(tǒng)比較小鼠全身類過敏試驗(yàn)方法(MSAR)與小鼠(耳廓藍(lán)染)類過敏反應(yīng)評(píng)價(jià)方法(MAP),本研究選用C48/80、Tween–80、聚氧乙烯蓖麻油(Cr EL)、碘海醇、紫杉醇、注射用血塞通(凍干)和注射用雙黃連(凍干)等藥物,就兩種方法各指標(biāo)對(duì)受試物誘導(dǎo)類過敏發(fā)生的反應(yīng)性、各指標(biāo)與給藥劑量的相關(guān)性、基于各內(nèi)置指標(biāo)及共有指標(biāo)綜合評(píng)定結(jié)果的反應(yīng)性、敏感性、特異性、與臨床一致性等進(jìn)行全面的比較。探尋和推薦一種敏感性高、特異性強(qiáng)、與臨床一致性好的類過敏評(píng)價(jià)方法。同時(shí)采用大鼠嗜堿性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞(Rat basophilic leukemia cells,RBL-2H3)模型,對(duì)兩種類過敏試驗(yàn)方法的差異影響因素進(jìn)行初步分析。
方法：
(1)陽性物質(zhì)C48/80靜脈注射后,MSAR進(jìn)行癥狀評(píng)定并檢測(cè)血液組胺、β-氨基己糖苷酶、類胰蛋白酶;MAP統(tǒng)計(jì)藍(lán)染情況,同時(shí)進(jìn)行癥狀評(píng)定并檢測(cè)血液生物標(biāo)志物組胺。對(duì)各內(nèi)置指標(biāo)的反應(yīng)性及其與劑量的相關(guān)性進(jìn)行分析,對(duì)基于MSAR和MAP兩種方法各內(nèi)置指標(biāo)檢測(cè)的評(píng)定結(jié)果以及共有指標(biāo)全身癥狀和血液組胺檢測(cè)的評(píng)定結(jié)果進(jìn)行比較,就兩種方法對(duì)C48/80類過敏性評(píng)定的特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。
(2)選用注射劑常用輔料Tween-80和Cr EL、碘海醇、紫杉醇、注射用血塞通(凍干)及注射用雙黃連(凍干)為研究對(duì)象,就其靜脈注射后對(duì)MSAR和MAP各指標(biāo)的影響進(jìn)行檢測(cè),在此基礎(chǔ)上,參照第一節(jié)C48/80對(duì)兩種方法各內(nèi)置指標(biāo)及共有指標(biāo)的特征進(jìn)行分析和比較,從藥物類過敏性評(píng)定的反應(yīng)性、敏感性、特異性以及與臨床一致性的角度,就兩種方法對(duì)受試物類過敏性評(píng)定的適用性進(jìn)行評(píng)價(jià)。
(3)選用RBL-2H3細(xì)胞模型,檢測(cè)受試物中加EB(體外等效劑量為0.011%EB)和不加EB誘發(fā)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放至上清液中的組胺水平,比較和初步分析EB隨類過敏反應(yīng)陽性物質(zhì)一同注入血液后可能對(duì)RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放活性物質(zhì)的影響。
結(jié)果：
(1)兩種方法內(nèi)置指標(biāo)與共有指標(biāo)評(píng)判C48/80致小鼠發(fā)生類過敏反應(yīng)的敏感性中MSAR均優(yōu)于MAP;癥狀觀察及血液組胺檢測(cè)指標(biāo)可以引入MAP中,且敏感性優(yōu)于其內(nèi)置指標(biāo),可作為MAP發(fā)生類過敏反應(yīng)的評(píng)判指標(biāo)。
(2)以兩種方法各內(nèi)置指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判,Tween-80、Cr EL、碘海醇、血塞通、雙黃連致小鼠發(fā)生類過敏反應(yīng)的敏感性中MSAR均優(yōu)于MAP;以兩種方法共有指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判,血塞通、碘海醇致小鼠發(fā)生類過敏反應(yīng)的敏感性中MSAR優(yōu)于MAP;以MAP中內(nèi)置指標(biāo)與新引入指標(biāo)進(jìn)行評(píng)判,Tween-80、Cr EL、碘海醇、雙黃連致小鼠發(fā)生類過敏反應(yīng)的敏感性中新引入指標(biāo)優(yōu)于內(nèi)置指標(biāo),紫杉醇內(nèi)置指標(biāo)敏感性優(yōu)于新引入指標(biāo),血塞通兩者敏感性相近。
(3)EB與C48/80混合,會(huì)影響其致RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放組胺的程度,但與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有出入,有待深入研究。EB與血塞通、Cr EL混合后其致RBL-2H3細(xì)胞脫顆粒釋放組胺的趨勢(shì)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近,但是否影響了組胺釋放程度,有待進(jìn)一步研究。
結(jié)論：
(1)敏感性比較:以單一方法諸多內(nèi)置指標(biāo)中對(duì)類過敏反應(yīng)呈陽性的起始劑量或與對(duì)照組比具有顯著性差異的最小劑量作為評(píng)價(jià)兩種方法敏感性的指標(biāo),則MSAR的敏感性明顯高于MAP。
(2)相同檢測(cè)指標(biāo)的敏感性比較:以癥狀強(qiáng)度系數(shù)和血液組胺作為共同評(píng)判指標(biāo),兩種方法均表現(xiàn)為指標(biāo)隨給藥劑量升高而增加,呈明顯的量效關(guān)系,但MSAR兩指標(biāo)的檢測(cè)敏感性顯著高于MAP。
(3)上述分析結(jié)果提示,MSAR無論在能顯示類過敏反應(yīng)量效關(guān)系方面,還是在檢測(cè)敏感性方面均優(yōu)于MAP,建議推薦和驗(yàn)證。
(4)EB的加入可能影響了藥物致RBL-2H3細(xì)胞類過敏反應(yīng)的程度。
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