一、背景
人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞源自于一名19歲車(chē)禍罹難的健康男性的視網(wǎng)膜組織，由Amy Aotaki-Keen建系于1986年。該細(xì)胞系表達(dá)視網(wǎng)膜色素細(xì)胞特有的分子標(biāo)記如胞內(nèi)視黃醛結(jié)合蛋白和PRE-65。
視網(wǎng)膜色素上皮位于脈絡(luò)膜和光感受器細(xì)胞外節(jié)之間，是視網(wǎng)膜下腔和脈絡(luò)膜血管之間的離子、水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝終產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)通道。視網(wǎng)膜色素上皮參與視黃醇循環(huán)，吞噬脫落的光感受器細(xì)胞外節(jié)以維持光感受器細(xì)胞興奮性，并分泌多種生長(zhǎng)因子，幫助維持脈絡(luò)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞和光感受器細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞分為三部分，即頂部、體部和基底部。
人視網(wǎng)膜是由位于眼睛后部多層結(jié)構(gòu)組成的。它包括視細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE），視網(wǎng)膜色素細(xì)胞通過(guò)提供營(yíng)養(yǎng)和代謝廢物來(lái)滋養(yǎng)視網(wǎng)膜。RPE位于神經(jīng)視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間，成為血視網(wǎng)膜屏障的外層控制著視網(wǎng)膜下間隙的化學(xué)成分，人們發(fā)現(xiàn)RPE在許多蛋白質(zhì)的極性方面不同于其他上皮細(xì)胞。
幾乎所有的上皮細(xì)胞的頂生面都沒(méi)有基質(zhì)，而RPE的頂生面胞膜是與細(xì)胞外基質(zhì)相接觸的。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，RPE自發(fā)轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)視網(wǎng)膜組織，RPE在其鄰近的光感受器的發(fā)育和維持中有著重要的作用，光照條件下RPE能產(chǎn)生大量的活性氧，RPE的增殖也是許多眼病發(fā)病過(guò)程中重要的一步，如增殖性視網(wǎng)膜病變。
二、細(xì)胞特性
1)組織來(lái)源于人的正常眼組織。
2)細(xì)胞鑒定：細(xì)胞角蛋白-8(CK-8)免疫熒光染色為陽(yáng)性。
3)經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%。
4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌。
5)細(xì)胞生長(zhǎng)方式：上皮樣，不規(guī)則細(xì)胞，貼壁培養(yǎng)。
三、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法
1、細(xì)胞傳代:細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代
①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次;
②加入2ml0.25%胰酶(T25瓶),使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿,蓋好放入培養(yǎng)箱消化;
③1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化;若細(xì)胞還是貼壁,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止;
④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清;
⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中,T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基;
2、細(xì)胞復(fù)蘇:
①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化,時(shí)間1min左右,加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。
②在1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻,將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。
3、細(xì)胞凍存:待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種
①棄去培養(yǎng)上清,用PBS或生理鹽水清洗1-2次,加入1mL 0.25%胰蛋白酶(T25瓶)
②1-2min后,顯微鏡下觀察細(xì)胞,大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落,輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化;
③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min,棄上清,加1ml凍存液重懸細(xì)胞;
④將凍存管放入程序降溫盒,放入-80℃冰箱,4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。
四、應(yīng)用
人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以用于慢病毒介導(dǎo)ERRα基因過(guò)表達(dá)在藍(lán)光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡中的作用研究：
探討慢病毒介導(dǎo)的ERRα基因(Estrogen-related nuclear receptorα,ERRα)過(guò)表達(dá)對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用,為防治視網(wǎng)膜光損傷類(lèi)疾病以及深入理解年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)病機(jī)制甚至保護(hù)性靶標(biāo)基因的探索提供理論依據(jù)。
方法：將過(guò)表達(dá)ERRα基因的重組慢病毒和空載體慢病毒轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19細(xì)胞株),使用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)ERRα基因的ARPE-19細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組,感染空載體慢病毒的ARPE-19細(xì)胞作為對(duì)照組(NC組),待細(xì)胞生長(zhǎng)至狀態(tài)良好后采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-q PCR)和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中ERRαm RNA和蛋白的表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染是否成功。
轉(zhuǎn)染成功后將兩組細(xì)胞置于無(wú)藍(lán)光照射的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、和置于藍(lán)光波長(zhǎng)為460nm,光照強(qiáng)度為2000±500Lux的藍(lán)光損傷模型再放于培養(yǎng)箱中6小時(shí),后將兩組繼續(xù)避光孵育24小時(shí),最后使用RT-q PCR檢測(cè)各組凋亡相關(guān)標(biāo)志物Caspase-3、Caspase-9、Bax和抗凋亡相關(guān)標(biāo)志物Bcl-2 m RNA的表達(dá),Western blot對(duì)各組凋亡相關(guān)標(biāo)志物Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9、Bax和抗凋亡相關(guān)標(biāo)志物Bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
結(jié)果：
(1)慢病毒轉(zhuǎn)染ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng)成功,空載體慢病毒轉(zhuǎn)染組(NC組)ERRαm RNA表達(dá)量和蛋白表達(dá)量較少,ERRα過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染組ERRαm RNA和蛋白表達(dá)量明顯增多。
(2)藍(lán)光照射能使ARPE-19細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,且不經(jīng)過(guò)ERRα過(guò)表達(dá)處理的細(xì)胞異形更多。
(3)藍(lán)光能誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。
(4)ERRα過(guò)表達(dá)組和空載體組(NC組)經(jīng)過(guò)藍(lán)光光照6小時(shí)后,ERRα過(guò)表達(dá)組較NC組的凋亡相關(guān)標(biāo)志物m RNA和蛋白表達(dá)量降低,抗凋亡相關(guān)標(biāo)志物m RNA和蛋白的表達(dá)量升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論：慢病毒介導(dǎo)的ERRα基因過(guò)表達(dá)可以對(duì)抗由藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡,從而保護(hù)細(xì)胞,具體機(jī)制需進(jìn)一步探究。ERRα的保護(hù)作用可能從分子水平上為年齡相關(guān)性黃斑變性或光損傷疾病治療提供幫助。
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