駑巴貝斯蟲PCR試劑盒的背景與應(yīng)用及培養(yǎng)操作！
小楊 / 2024-01-15 08:51:51
一、背景
駑巴貝斯蟲PCR試劑盒一種用于檢測駑巴貝斯蟲的生物試劑盒，采用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測。該試劑盒可以在動植物體外對特定基因（DNA）片段進(jìn)行快速酶促擴(kuò)增，經(jīng)過多個循環(huán)擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定基因，從而實(shí)現(xiàn)對駑巴貝斯蟲的檢測。
駑巴貝斯蟲是一種寄生蟲，可以感染人類和動物，引起瘧疾、腹瀉等癥狀。
駑巴貝斯蟲PCR試劑盒包含PCR反應(yīng)體系、引物、熒光探針等成分，可以擴(kuò)增出駑巴貝斯蟲的DNA片段，并通過熒光信號檢測來確定是否存在駑巴貝斯蟲感染。
使用駑巴貝斯蟲PCR試劑盒時，需要從患者或動物樣本中提取DNA，并將其加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。如果樣本中存在駑巴貝斯蟲的DNA，則PCR反應(yīng)會產(chǎn)生熒光信號，從而可以確定是否存在感染。
1、樣本處理：將待檢樣本的核酸提取，可以使用病毒RNA提取試劑盒或自動化核酸提取儀等。
2、準(zhǔn)備試劑：按照試劑盒說明書中的指示，準(zhǔn)備所需的試劑和材料，例如PCR反應(yīng)液、引物、DNA模板等。
3、配置反應(yīng)體系：根據(jù)試劑盒說明書中的指示，配置PCR反應(yīng)體系，包括PCR反應(yīng)液、引物、DNA模板等。
4、設(shè)定PCR程序：根據(jù)試劑盒說明書中的指示，設(shè)定PCR程序，包括變性、退火、延伸等溫度和時間。
5、運(yùn)行PCR程序：將配置好的PCR反應(yīng)體系放入PCR儀中，運(yùn)行設(shè)定的PCR程序。
6、結(jié)果分析：在PCR程序運(yùn)行結(jié)束后，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳或其他方法檢測，以判斷是否擴(kuò)增出特定基因片段，從而實(shí)現(xiàn)對駑巴貝斯蟲的檢測。
三、應(yīng)用
馬駑巴貝斯蟲病病原為駑巴貝斯蟲,該病是一種經(jīng)由媒介蜱蟲傳播的嚴(yán)重影響馬屬動物健康的血液原蟲病,被世界衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報告檢疫疫病,在我國該病被列為二類動物疫病。該病呈全球性發(fā)生,患馬呈現(xiàn)發(fā)熱、貧血、黃疸、血紅蛋白尿,急性病例死亡,亞急性、慢性病例終身成為帶蟲宿主,造成本土馬與引進(jìn)馬互相感染、反復(fù)發(fā)病,給馬養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。目前尚無該病的有效治療藥物及疫苗,故研發(fā)新型檢測技術(shù)是有效的防控途徑,可及時檢測、監(jiān)控和綜合防治,有利于馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。
使用駑巴貝斯蟲PCR試劑盒并根據(jù)GenBank中的駑巴貝斯蟲(Babesia caballi)Bc48基因序列設(shè)計了一對特異性引物,建立檢測駑巴貝斯蟲的二溫式PCR方法。該方法能夠特異地擴(kuò)增155 bp的片段,與雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、馬泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲均無交叉反應(yīng),能檢測到的最低DNA拷貝數(shù)為5.17×102 copies/μL。應(yīng)用所建立的方法檢測了采集于和靜縣焉耆馬匹樣品(N=82),結(jié)果顯示,馬駑巴貝斯蟲感染率69.51%(57/82),與血液涂片檢查結(jié)果37.8%(31/82)相比,其檢出率更高。該駑巴貝斯蟲PCR試劑盒二溫式PCR檢測方法具有較高的特異性和敏感性,可用于馬駑巴貝斯蟲的早期診斷。
(Ⅱ)根據(jù)Bc48保守部分基因序列設(shè)計合成特異性引物和MGB熒光探針,建立了駑巴貝斯蟲病的MGB FQ-PCR檢測方法。對所建立的FQ-PCR檢測方法進(jìn)行特異性、靈敏性和重復(fù)性試驗,并分別用FQ-PCR檢測方法和普通PCR方法對臨床樣品進(jìn)行檢測對比。結(jié)果顯示,該方法靈敏度高,最小檢出量為5.17×101copies/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒,比常規(guī)PCR靈敏100倍;建立的FQ-PCR檢測方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的循環(huán)閾值與模板濃度具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.9996,重復(fù)性好,組內(nèi)與組間重復(fù)性試驗的變異系數(shù)分別為0.7%和0.42%,均小于1%;該方法能特異性檢測駑巴貝斯蟲,而對馬泰勒蟲、雙芽巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲等病原檢測結(jié)果均為陰性。用建立的MGB-FQ PCR和使用駑巴貝斯蟲PCR試劑盒的常規(guī)PCR分別對90份臨床樣品進(jìn)行檢測,MGB-FQ PCR和常規(guī)PCR檢出率分別為53%和30%。本次建立的駑巴貝斯蟲病MGB-FQ PCR檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好,可用于馬駑巴貝斯蟲病臨床樣品診斷、流行病學(xué)調(diào)查,將為蜱傳馬梨形蟲病的檢測提供新的方法。
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