NRK（大鼠腎細(xì)胞）的特點(diǎn)與培養(yǎng)及應(yīng)用！
小楊 / 2024-02-15 09:57:12
一、背景
NRK（大鼠腎細(xì)胞）是一種來(lái)源于正常大鼠腎臟的細(xì)胞系，常用于研究腎臟生物學(xué)、藥物篩選、毒性測(cè)試以及病毒學(xué)研究。
來(lái)源：NRK細(xì)胞系是從正常大鼠腎臟組織中建立的，通過(guò)多次傳代培養(yǎng)而形成穩(wěn)定的細(xì)胞系。
形態(tài)特征：NRK細(xì)胞通常呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞樣的形態(tài)，呈梭形或多角形，細(xì)胞大小和形態(tài)可能會(huì)根據(jù)培養(yǎng)條件和細(xì)胞密度而有所變化。
生長(zhǎng)特性：NRK細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)條件下（如含有適量胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基）可以穩(wěn)定生長(zhǎng)，具有較快的增殖速率。
應(yīng)用：由于NRK細(xì)胞來(lái)源于正常的腎臟組織，它們常用于研究腎臟細(xì)胞的生理和病理過(guò)程，以及作為體外模型來(lái)評(píng)估藥物的腎臟毒性。此外，NRK細(xì)胞也被用于研究病毒感染，尤其是那些能夠感染腎臟細(xì)胞的病毒。
變異株：NRK細(xì)胞系有幾個(gè)亞型，如NRK-49F和NRK-52E，這些亞型可能具有不同的特性和應(yīng)用領(lǐng)域。
優(yōu)勢(shì)：NRK細(xì)胞系的優(yōu)勢(shì)在于它們相對(duì)容易培養(yǎng)，生長(zhǎng)迅速，且能夠代表正常腎臟細(xì)胞的特性，這使得它們成為研究腎臟相關(guān)疾病的理想模型。
1)復(fù)蘇NRK細(xì)胞系：以下細(xì)胞培養(yǎng)凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)為主。
將含有1 mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10 cm皿中，加入約8 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。
2)NRK細(xì)胞系傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
a、棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，使消化液浸潤(rùn)所有細(xì)胞，棄去消化液，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1 min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。
c、按6-8 mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm離心4 min，棄去上清液，補(bǔ)加1-2 mL培養(yǎng)液后吹勻。
d、將細(xì)胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
3)NRK細(xì)胞系凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，裝入無(wú)菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
b、根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入無(wú)血清細(xì)胞凍存液，使細(xì)胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液，注意凍存管做好標(biāo)識(shí)。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
四、應(yīng)用
腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)是腫瘤微環(huán)境(Tumor microenvironment,TME)中的主要成分。靶向CAFs治療已成為腫瘤治療中一種有前景的治療方式。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序、綜合生物信息學(xué)分析以及細(xì)胞、臨床標(biāo)本檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)CAFs高表達(dá)NRK(Nik-related kinase),并且我們進(jìn)一步探究CAFs高表達(dá)NRK對(duì)肺腺癌細(xì)胞遷移侵襲的作用及相關(guān)機(jī)制,為靶向CAFs治療提供新的潛在靶點(diǎn)。
方法：
1、收集肺腺癌新鮮手術(shù)標(biāo)本,采用組織塊貼壁培養(yǎng)法,分離CAFs、正常肺成纖維細(xì)胞(Normal Fibroblasts,NFs)。光學(xué)顯微鏡觀察CAFs、NFs形態(tài)、蛋白免疫印跡法(Western Blot,WB)和免疫熒光(Immunofluorescence,IF)檢測(cè)成纖維細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá),鑒定成纖維細(xì)胞。
2、收集培養(yǎng)CAFs、NFs細(xì)胞72小時(shí)后的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基,離心后取上清,得到CAF條件培養(yǎng)基(Cancer associated fibroblasts conditional medium,CAF-CM)和NFs條件培養(yǎng)基(Normal fibroblasts conditional medium,NF-CM)。檢測(cè)CAF-CM、NF-CM對(duì)肺腺癌細(xì)胞(A549和H1299)增殖、侵襲、遷移的影響。
3、根據(jù)我們本次CAFs測(cè)序數(shù)據(jù)集,結(jié)合課題組前期CAFs基因芯片數(shù)據(jù)集,以及Array Express公共數(shù)據(jù)庫(kù)肺腺癌CAFs差異基因數(shù)據(jù)集,通過(guò)韋恩圖,尋找這三個(gè)數(shù)據(jù)集差異倍數(shù)(Fold Change,FC)的絕對(duì)值大于2,校正P值小于0.05的共有差異基因。最終得到10個(gè)交集差異基因(ZNF93、ZNF827、NRK、DPYSL4、HES4、LYPD6B、SETBP1、HMCN1、FCGBP、CFI)。q RT-PCR檢測(cè)上述10個(gè)交集差異基因在CAFs的相對(duì)表達(dá)水平。q RT-PCR、WB、IF檢測(cè)CAFs中NRK的表達(dá)水平。
4、采用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)法,檢測(cè)NRK在肺腺癌組織、癌旁組織的表達(dá),分析NRK在肺腺癌的表達(dá)水平和臨床病理因素的關(guān)系。
5、構(gòu)建NRK干擾慢病毒載體和過(guò)表達(dá)質(zhì)粒,在CAFs、NFs分別干擾、過(guò)表達(dá)NRK基因,q RT-PCR、WB檢測(cè)干擾或過(guò)表達(dá)NRK的效果。6.收集干擾或過(guò)表達(dá)NRK的CAFs條件培養(yǎng)基(CAF-sh NRK-CM)、NFs條件培養(yǎng)基(NF-OE-CM)。檢測(cè)CAF-sh NRK-CM、NF-OE-CM對(duì)A549、H1299細(xì)胞的遷移、侵襲的影響,ELISA檢測(cè)條件培養(yǎng)基中CXCL5的變化。
6、劃痕法、Transwell法、WB、IF檢測(cè)干擾過(guò)或表達(dá)NRK對(duì)CAFs、NFs運(yùn)動(dòng)能力的影響、磷酸化Cofilin(p-Cofilin)蛋白表達(dá)水平的影響、F-actin的變化。
7、共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀察干擾NRK對(duì)CAFs引導(dǎo)A549、H1299運(yùn)動(dòng)的影響。
結(jié)果：
1、光鏡下可見(jiàn),NFs、CAFs形態(tài)相似,呈紡錘形,CAFs細(xì)胞體積較NFs更大。WB和IF結(jié)果顯示,NFs、CAFs均高表達(dá)細(xì)胞間質(zhì)標(biāo)志物波形蛋白(Vimentin),不表達(dá)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白(E-cadherin)。同時(shí)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、FAP-α的表達(dá)在CAFs高于NFs,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
2、與NF-CM相比,CAF-CM能夠促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞(A549和H1299)增殖、遷移、侵襲,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
3、通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序、綜合生物信息學(xué)分析和q RT-PCR檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)NRK是10個(gè)交集差異基因中,在CAFs表達(dá)顯著升高的上調(diào)差異基因,q RT-PCR、WB、IF結(jié)果顯示,NRK主要在CAFs高表達(dá)(P<0.05),IF結(jié)果提示,NRK主要定位在CAFs的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
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